Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên mô hình lão hóa da do tia cực tím

Luận án tiến sĩ y học Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên mô hình lão hóa da do tia cực tím. Lão hóa da là quá trình thay đổi cấu trúc và suy giảm chức năng sinh lý của da dưới tác động của yếu tố nội sinh và ngoại sinh. Trong đó, ánh sáng mặt trời, đặc biệt là tia cực tím (UV), đóng vai trò chính làm khởi phát sớm và trầm trọng thêm tình trạng lão hóa [1]. Thực tế, hơn 80% các dấu hiệu lão hóa da có liên quan đến tiếp xúc với tia UV [2]. Lão hóa da do tia UV không chỉ gây thay đổi cấu trúc da như da khô, sần sùi, chùn nhão với nhiều nếp nhăn sâu, mà còn ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của da như tổn thương hàng rào bảo vệ da, tăng mất nước qua da, tăng nguy cơ nhiễm khuẩn và giảm khả năng lành thương [2]. Cơ chế của lão hóa da bao gồm nhiều yếu tố như nguyên bào sợi (HDF) già hóa, giảm sinh tổng hợp collagen, tăng sản xuất các men gây thoái giáng chất nền ngoại bào (MMPs) và tăng sản sinh các chất oxy hóa, hậu quả làm giảm khả năng tái tạo của da [1,3]. Hiện nay, các phương pháp điều trị và phòng ngừa lão hóa da do tia UV vẫn còn nhiều hạn chế về hiệu quả và có nhiều tác dụng phụ như gây đau, kích ứng, tăng sắc tố sau viêm [4].

Gần đây, tế bào gốc trung mô (MSC) là liệu pháp sinh học đã cho thấy hiệu quả trong điều trị lão hóa da [5]. Một trong những cơ chế tác động chính của tế bào gốc là nhờ những thành phần túi ngoại bào, trong đó exosome là loại túi cho thấy nhiều tiềm năng trong điều trị. Exosome là túi ngoại bào có kích thước nhỏ, mang nhiều phân tử sinh học đặc trưng cho tế bào tiết ra nó, giúp vận chuyển và truyền tín hiệu đến tế bào đích [6–8]. Exosome từ MSC bước đầu thể hiện tiềm năng cải thiện lão hóa da thông qua kích thích HDF tổng hợp collagen, elastin và ức chế hoạt động của MMP nhờ các thành phần như microRNA (miRNA) [9]. Nghiên cứu in vitro cho thấy exosome từ tế bào gốc mô mỡ (ADSC) kích thích sự tăng sinh, di cư của HDF, đồng thời thúc đẩy tế bào tổng hợp collagen loại I, elastin và yếu tố tăng trưởng thượng bì (EGF). Ở cấp độ phân tử, các miRNA trong exosome từ ADSC cho thấy khả năng ức chế các gen liên quan đến lão hóa tế bào [10]. Mặc dù cơ chế tác động của exosome ngày càng được hiểu rõ, thách thức lớn của việc ứng dụng exosome hiện2 nay là gia tăng số lượng và hoạt tính của exosome để tạo nên đáp ứng điều trị trên lâm sàng [8].
Trong các phương pháp biến đổi exosome nhằm tăng cường hiệu quả điều trị, nuôi cấy MSC trong điều kiện oxy thấp (hypoxia) là phương pháp đơn giản và cho thấy hiệu quả cao. Môi trường oxy thấp đã được chứng minh bên cạnh khả năng thúc đẩy tế bào tăng sinh, di cư và biệt hóa, còn làm tăng hoạt động cận tiết thông qua hoạt hóa trục HIF-1α, từ đó tế bào tiết ra nhiều exosome hơn (hypoxic exosome) [11].
Không chỉ gia tăng về số lượng, hypoxic exosome còn cho thấy sự thay đổi thành phần sinh học so với exosome từ tế bào trong điều kiện đủ oxy (normoxic exosome), từ đó gia tăng hoạt tính sinh học và nâng cao hiệu quả điều trị [12–14]. Cụ thể, hypoxic exosome từ ADSC đã cho thấy khả năng giảm các gốc tự do, giảm biểu hiện các yếu tố gây viêm như IL-1β, TNF-α và IL-6 tại mô da, đồng thời hạn chế thoái giáng collagen loại I tốt hơn normoxic exosome từ ADSC [15].
Từ những cơ sở khoa học trên, giả thuyết đặt ra là hypoxic exosome từ ADSC có khả năng cải thiện lão hóa da do tia UV. Cho đến nay, trên thế giới và tại Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu đề cập đến vấn đề này. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên mô hình lão hóa da do tia cực tím” nhằm đánh giá tác dụng của hypoxic exosome từ ADSC trong cải thiện lão hóa da do tia UV trên mô hình thực nghiệm in vitro và in vivo.
Đề tài bao gồm những mục tiêu sau:
1. Tạo được nguyên bào sợi người lão hóa do tia cực tím;
2. Tạo được mô hình chuột BALB/c lão hóa da do tia cực tím;
3. Đánh giá được tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên nguyên bào sợi người lão hóa do tia cực tím;
4. Đánh giá được tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên mô hình chuột lão hóa da do tia cực tím

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ xii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về lão hóa da do tia cực tím ………………………………………………..3
1.2. Mô hình thực nghiệm lão hóa da do tia cực tím…………………………………..17
1.3. Exosome từ tế bào gốc mô mỡ trong điều trị lão hóa da……………………….21
1.4. Exosome từ tế bào gốc mô mỡ nuôi trong môi trường oxy thấp trong cải
thiện lão hóa da………………………………………………………………………………………30
1.5. Tình hình nghiên cứu về vai trò của hypoxic exosome từ tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ trong cải thiện lão hóa da…………………………………………………….36
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1.Thiết kế nghiên cứu ………………………………………………………………………….38
2.2. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………………38
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……………………………………………………..38
2.4. Cỡ mẫu cho thí nghiệm trên động vật ………………………………………………..39
2.5. Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc………………………………………….39
2.6. Quy trình nghiên cứu ……………………………………………………………………….43
2.7. Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu……………………………..44
2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu ………………………………………………………….72
2.9. Đạo đức trong nghiên cứu ………………………………………………………………..72iv
Chương 3. KẾT QUẢ 74
3.1. Định danh hypoxic exosome từ dịch nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
…………………………………………………………………………………………………………….74
3.2. Kết quả tạo mô hình nguyên bào sợi người lão hóa do tia cực tím…………75
3.3. Kết quả tạo mô hình chuột lão hóa da do tia cực tím ……………………………83
3.4. Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên nguyên bào
sợi người lão hóa do tia cực tím ……………………………………………………………….96
3.5. Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên mô hình
chuột lão hóa da do tia cực tím……………………………………………………………….101
Chương 4. BÀN LUẬN 112
4.1. Định danh hypoxic exosome từ dịch nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
……………………………………………………………………………………………….112
4.2. Mô hình nguyên bào sợi người lão hóa do tia cực tím ………………………..113
4.3. Mô hình chuột lão hóa da do tia cực tím …………………………………………..121
4.4. Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên nguyên bào
sợi người lão hóa do tia cực tím ……………………………………………………………..132
4.5. Tác dụng của hypoxic exosome từ tế bào gốc mô mỡ người trên chuột lão
hóa da do tia cực tím……………………………………………………………………………..137
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 147
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: GIẤY CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG
NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỘNG VẬT
PHỤ LỤC 2: GIẤY CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG
NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC
PHỤ LỤC 3: PHIẾU ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 4: THÔNG TIN BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨUv
PHỤ LỤC 5: CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
PHỤ LỤC 6: CÁC CÔNG CỤ, THANG ĐO, CÁC THAM CHIẾU
PHỤ LỤC 7: CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU MẪU, TRANH ẢNH
PHỤ LỤC 8: CÁC SỐ LIỆU PHÂN TÍCH TRONG NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 9: KẾT QUẢ GIẢI PHẪU BỆNH MINH HỌ

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Biểu hiện lâm sàng của lão hóa da do ánh sáng……………………………………7
Hình 1.2. Đặc điểm mô học của da bình thường và da lão hóa do ánh sáng …………..8
Hình 1.3. Tác động của tia cực tím lên tế bào thượng bì và nguyên bào sợi…………..9
Hình 1.4. Con đường hình thành exosome……………………………………………………….23
Hình 1.5. Con đường hình thành exosome cổ điển……………………………………………24
Hình 1.6. Cấu trúc của exosome …………………………………………………………………….25
Hình 1.7. Vai trò của HIF-1 trong điều kiện thiếu oxy………………………………………32
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu……………………………………………………………………………43
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tạo nguyên bào sợi lão hóa do tia UV ……………………..56
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tạo mô hình chuột lão hóa da do tia UV…………………..63
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện lão hóa nguyên bào sợi của
hypoxic exosome………………………………………………………………………………………….68
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện lão hóa da ở chuột bằng
exosome………………………………………………………………………………………………………71
Hình 3.1. Các đặc tính của exosome……………………………………………………………….74
Hình 3.2. Hình dạng và sự tăng sinh của nguyên bào sợi…………………………………..75
Hình 3.3. Biểu hiện kiểu hình của nguyên bào sợi người thế hệ 4 ………………………76
Hình 3.4. Hình dạng tế bào sau khi chiếu tia cực tím với các liều khác nhau ……….77
Hình 3.5. Hình dạng, khả năng bám dính của tế bào sau chiếu tia cực tím…………..78
Hình 3.6. Sự thay đổi kích thước nguyên bào sợi sau chiếu tia cực tím……………….79
Hình 3.7. Nguyên bào sợi biểu hiện kiểu hình lão hóa sau chiếu tia cực tím………..80
Hình 3.8. Đáp ứng của da chuột sau chiếu tia cực tím với các liều khác nhau………83
Hình 3.9. Biểu hiện bề mặt da chuột sau chiếu tia cực tím…………………………………84
Hình 3.10. Mô học da chuột nhuộm H&E ……………………………………………………….89
Hình 3.11. Sự thay đổi độ dày thượng bì, lớp bì trên mô học H&E …………………….90
Hình 3.12. Sự thay đổi của collagen trên mô học nhuộm Masson’s Trichrome…….92
Hình 3.13. Sự thay đổi mật độ collagen sau chiếu tia cực tím…………………………….93
Hình 3.14. Theo dõi biểu hiện da lão hóa ở chuột sau khi ngưng chiếu tia cực tím.95xi
Hình 3.15. Tác dụng của hypADSC-Exo lên sự thay đổi hình dạng của nguyên bào
sợi lão hóa …………………………………………………………………………………………………..96
Hình 3.16. Tác dụng của hypADSC-Exo lên sự thay đổi kích thước của nguyên bào
sợi lão hóa …………………………………………………………………………………………………..97
Hình 3.17. Tác dụng của hypADSC-Exo lên kiểu hình lão hóa nguyên bào sợi……99
Hình 3.18. Tác dụng của hypADSC-Exo lên biểu hiện da lão hóa ở chuột ………..101
Hình 3.19. Tác dụng của hypADSC-Exo lên mô học da chuột lão hóa ……………..105
Hình 3.20. Tác dụng của hypADSC-Exo lên collagen lớp bì ở da chuột lão hóa ..10

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi kích thước nguyên bào sợi sau chiếu tia cực tím …………..79
Biểu đồ 3.2. Nguyên bào sợi biểu hiện kiểu hình lão hóa sau chiếu tia cực tím ……81
Biểu đồ 3.3. Khả năng tăng sinh của nguyên bào sợi sau chiếu tia cực tím ………….81
Biểu đồ 3.4. Biểu hiện gen của nguyên bào sợi sau chiếu tia cực tím………………….82
Biểu đồ 3.5. Biểu hiện điểm nhăn da sau chiếu tia cực tím ………………………………..84
Biểu đồ 3.6. Sự thay đổi cân nặng của chuột sau chiếu tia cực tím……………………..85
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi độ dày nếp gấp da của chuột sau chiếu tia cực tím………..86
Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi độ đàn hồi da chuột sau chiếu tia cực tím …………………….87
Biểu đồ 3.9. Sự thay đổi độ ẩm da chuột sau chiếu tia cực tím …………………………..88
Biểu đồ 3.10. Sự thay đổi độ dày thượng bì, lớp bì sau chiếu tia cực tím…………….91
Biểu đồ 3.11. Sự thay đổi mật độ collagen sau chiếu tia cực tím ………………………..94
Biểu đồ 3.12. Biểu hiện mRNA của COL1A1, COL3A1, MMP1, MMP2 và MMP3
trong da chuột sau chiếu tia cực tím………………………………………………………………..94
Biểu đồ 3.13. Tác dụng của hypADSC-Exo lên sự thay đổi kích thước của nguyên
bào sợi lão hóa……………………………………………………………………………………………..98
Biểu đồ 3.14. Tác dụng của hypADSC-Exo lên kiểu hình lão hóa nguyên bào sợi .99
Biểu đồ 3.15. Tác dụng của hypADSC-Exo lên khả năng tăng sinh và biểu hiện gen
của nguyên bào sợi……………………………………………………………………………………..100
Biểu đồ 3.16. Tác dụng của hypADSC-Exo lên độ nhăn da ở chuột lão hóa da do tia
cực tím………………………………………………………………………………………………………102
Biểu đồ 3.17. Tác dụng của hypADSC-Exo lên cấu trúc và chức năng hàng rào bảo
vệ da ở chuột lão hóa da………………………………………………………………………………104
Biểu đồ 3.18. Tác dụng của hypADSC-Exo lên độ dày thượng bì và lớp bì……….106
Biểu đồ 3.19. Tác dụng của hypADSC-Exo lên collagen lớp bì ở da chuột lão hóa
…………………………………………………………………………………………………………………109
Biểu đồ 3.20. Tác dụng của hypADSC-Exo lên biểu hiện gen của COL1A1, COL3A1
và MMPs ở da chuột lão hóa………………………………………………………………………..11