Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV.Hiện nay, theo Tổ chức Y tế Thế giới ước tính trên toàn cầu có khoảng 296 triệu người nhiễm virus viêm gan B (Heptitis B virus: HBV) mạn tính. Hàng năm có khoảng 820.000 trường hợp tử vong liên quan đến các biến chứng của bệnh như viêm gan B mạn tính (VGBMT), xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma – HCC) [1]. Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ nhiễm HBV cao trong khu vực, chịu hậu quả nặng nề do nhiễm HBV gây ra.

Dữ liệu từ Bộ Y tế Việt Nam năm 2019 cho thấy tỉ lệ nhiễm HBV mạn tính từ 6 – 20% dân số, tương đương với khoảng 8 triệu người. Điều đó đặt ra một thách thức lớn cho hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng và trong theo dõi, quản lý điều trị người nhiễm HBV [2]. Deoxyribonucleic acid dạng vòng khép kín cộng hóa trị của HBV (cccDNA: Covalently closed circular Deoxyribonucleic acid ) đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại dai dẳng, duy trì và nhân lên của virus trong tế bào gan. cccDNA, dưới dạng một nhiễm sắc thể nhỏ, bền vững, đồng thời là khuôn mẫu sản xuất ra các Ribonucleic acid (RNA) như pgRNA (pregenomic RNA) và các mRNA mã hóa cho các protein của HBV[3]. Bên cạnh đó, hiện tại chưa có thuốc kháng virus nào có thể điều trị, thải trừ cccDNA ra khỏi người bệnh. HBV DNA vẫn là dấu ấn sinh học thường quy được sử dụng trong thực hành điều trị tuy nhiên lại không phản ánh chính xác sự hoạt động của cccDNA [4]. Trong khi đó, việc tách chiết và phân tích cccDNA đòi hỏi phải thực hiện sinh thiết gan, một kỹ thuật xâm lấn và thường không được sự hợp tác của nhiều người bệnh. Điều này làm cho quy trình xét nghiệm, phân tích cccDNA trở nên khó khả thi trong thực tế lâm sàng.
Chính vì vậy, việc tìm kiếm một dấu ấn trong huyết tương có khả năng dự đoán hoặc đại diện cho cccDNA có ý nghĩa quan trọng. HBV pgRNA (HBV RNA) là một sản phẩm phiên mã của cccDNA có lưu hành trong huyết tương,2 dấu ấn này có tiềm năng phản ánh trung thực tình trạng hoạt động của cccDNA trong tế bào gan [5], [6]. Tìm hiểu mối liên quan giữa cccDNA với HBV DNA, HBV RNA huyết tương có thể giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của bệnh và cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý, điều trị người bệnh nhiễm HBV, đặc biệt ở Việt Nam, nơi chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này. Xuất phát từ lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV” với hai mục tiêu sau:
1. Xác định nồng độ cccDNA tế bào gan, tải lượng HBV DNA và nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV.
2. Đánh giá mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA và nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV

MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………… 3
1.1. Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới và Việt Nam ………………………… 3
1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới…………………………………………….3
1.1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam………………………………………………4
1.2. Cơ chế bệnh sinh và diễn biến nhiễm HBV mạn…………………………… 5
1.2.1. Cơ chế bệnh sinh của bệnh do HBV gây ra ………………………………….5
1.2.2. Tiến trình tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính……………………………….7
1.3. Viêm gan virus B mạn tính và xơ gan do HBV…………………………… 10
1.3.1. Viêm gan virus B mạn tính ………………………………………………………..10
1.3.2. Xơ gan do HBV ………………………………………………………………………..12
1.4. Một số dấu ấn của HBV…………………………………………………………… 13
1.4.1. HBV DNA………………………………………………………………………………..13
1.4.2. HBV pgRNA – HBV RNA ……………………………………………………….15
1.4.3. cccDNA ……………………………………………………………………………………16
1.5 Các phương pháp định lượng HBV RNA và cccDNA…………………. 21
1.5.1. Một số phương pháp định lượng HBV RNA trong máu ngoại vi của
bệnh nhân VGBMT ………………………………………………………………….21
1.5.2. Một số phương pháp định lượng cccDNA trong tế bào gan…………22
1.6. Vai trò sinh thiết gan và hình ảnh mô bệnh học trong viêm gan virus…..301.7. Các nghiên cứu về cccDNA và HBV DNA, HBV RNA ở bệnh nhân
nhiễm HBV mạn trên Thế giới và Việt Nam……………………………… 31
1.7.1. Các nghiên cứu trên Thế giới……………………………………………………..31
1.7.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam……………………………………………………….35
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………… 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………………… 37
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn…………………………………………………………………..37
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ…………………………………………………………………….37
2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………….. 38
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu …………………………………………………………………..38
2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………38
2.2.3. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu ……………………………………………38
2.3. Các chỉ tiêu và nội dung nghiên cứu…………………………………………. 39
2.3.1. Các chỉ tiêu nghiên cứu ……………………………………………………………..39
2.3.2. Các nội dung nghiên cứu……………………………………………………………40
2.3.3. Phương pháp thu thập số liệu……………………………………………………..41
2.4. Kỹ thuật và phương tiện nghiên cứu………………………………………….. 41
2.4.1. Quy trình thu thập và bảo quản mẫu…………………………………………..41
2.4.2. Phương pháp thực hiện các chỉ tiêu xét nghiệm cơ bản……………….42
2.4.3. Phương pháp thực hiện các chỉ tiêu xét nghiệm sinh học phân tử..44
2.4.3. Phương pháp phân tích xử lý số liệu…………………………………………..60
2.5. Vấn đề đạo đức nghiên cứu………………………………………………………. 61
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………………….. 63
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ………………………………… 63
3.1.1. Tuổi và giới của bệnh nhân nghiên cứu………………………………………63
3.1.2. Một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở hai nhóm bệnh nhân64
3.2. Nồng độ cccDNA tế bào gan, tải lượng HBV DNA, nồng độ HBV RNA
huyết tương ở các bệnh nhân nghiên cứu ………………………………….. 683.2.1. Nồng độ cccDNA tế bào gan ở các nhóm bệnh nhân nghiên cứu ..68
3.2.2. Nồng độ HBV RNA huyết tương ở hai nhóm bệnh nhân nghiên
cứu………………………………………………………………………………… 72
3.2.3. Tải lượng HBV DNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu……………76
3.3. Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA với HBV DNA và HBV RNA ở
hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu………………………………………………. 81
3.3.1. Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA với tải lượng HBV DNA ở các
nhóm bệnh nhân……………………………………………………………………….81
3.3.2. Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết
tương ở hai nhóm bệnh nhân……………………………………………………..84
Chương 4: BÀN LUẬN ………………………………………………………………………. 90
4.1. Đặc điểm chung của các bệnh nhân nghiên cứu………………………….. 90
4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới tính……………………………………………………..90
4.1.2. Một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng ở hai nhóm bệnh
nhân nghiên cứu …………………………………………………………………….91
4.2. cccDNA tế bào gan, HBV RNA, HBV DNA huyết tương ở các bệnh nhân
nghiên cứu……………………………………………………………………………… 96
4.2.1. Nồng độ cccDNA ở các bệnh nhân nghiên cứu…………………………..96
4.2.2. Nồng độ HBV RNA ở các bệnh nhân nghiên cứu ………………………99
4.2.3. Tải lượng HBV DNA ở các bệnh nhân nghiên cứu …………………..104
4.3. Mối liên quan giữa cccDNA với HBV DNA và HBV RNA ở hai nhóm
bệnh nhân nghiên cứu …………………………………………………………… 108
4.3.1. Mối liên quan giữa cccDNA tế bào với HBV DNA huyết tương.108
4.3.2. Mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết
tương. ………………………………………………………………………….. 110
4.3.3. Mối tương quan giữa nồng độ HBV RNA với tải lượng HBV DNA
huyết tương…………………………………………………………………………….113
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 119HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI…………………………………………………………………… 121
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………….. 122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG
BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤ

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1. Các phương pháp trực tiếp được sử dụng trong định lượng cccDNA. 24
2.1. Giá trị bình thường các xét nghiệm sinh hóa ……………………………….43
2.2. Trình tự các mồi của phản ứng RCA như dưới đây ………………………46
2.3. Trình tự primer và probe của phản ứng real-time PCR định lượng
HBV cccDNA …………………………………………………………………………47
2.4. Chu trình nhiệt chạy máy Realtime PCR …………………………………….55
2.5. Thành phần phản ứng ……………………………………………………………….56
2.6. Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR……………………..57
3.1. Tuổi và giới của bệnh nhân nghiên cứu ………………………………………63
3.2. Một số triệu chứng lâm sàng thường gặp giữa hai nhóm bệnh nhân .64
3.3. Tình trạng mang kháng nguyên HBe ở hai nhóm bệnh nhân………….64
3.4. Hoạt độ ALT, AST và nồng độ Bilirubin TP ở 2 nhóm bệnh nhân…65
3.5. Đặc điểm về tiểu cầu ở 2 nhóm bệnh nhân ………………………………….66
3.6. Mức độ tổn thương và xơ hóa gan nhóm bệnh nhân VGBMT ……….66
3.7. Mối liên quan giữa mức độ tổn thương gan với HBeAg ở chung hai
nhóm bệnh nhân………………………………………………………………………67
3.8. Mức độ xơ hóa gan theo HBeAg ở chung hai nhóm bệnh nhân ……..67
3.9. Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với các chỉ tiêu
nghiên cứu ở nhóm VGBMT…………………………………………………….69
3.10. Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với một số chỉ tiêu
nghiên cứu ở nhóm xơ gan ……………………………………………………….70
3.11. Phân tích hồi quy đa biến các chỉ tiêu nghiên cứu ảnh hưởng đến
cccDNA ở nhóm VGBMT và Xơ gan ………………………………………..71Bảng Tên bảng Trang
3.12. So sánh nồng độ cccDNA tế bào gan theo mức độ tổn thương và xơ
hóa gan ở nhóm VGBMT …………………………………………………………71
3.13. Nồng độ HBV RNA huyết tương ở hai nhóm bệnh nhân nghiên
cứu…………………………………………………………………………………………72
3.14. Nồng độ HBV RNA huyết tương theo tình trạng HBeAg ở chung hai
nhóm. …………………………………………………………………………………….72
3.15. Mối liên quan giữa nồng độ HBV RNA huyết tương với một số chỉ
tiêu nghiên cứu ở chung hai nhóm……………………………………………..73
3.16. Mối liên quan giữa nồng độ HBV RNA huyết tương với các chỉ tiêu
nghiên cứu ở nhóm VGBMT…………………………………………………….74
3.17. Phân tích hồi quy đa biến các chỉ tiêu nghiên cứu ảnh hưởng đến
HBV RNA ở nhóm VGBMT và Xơ gan …………………………………….75
3.18. Nồng độ HBV RNA theo mức tổn thương gan và mức xơ hóa gan ở
chung hai nhóm bệnh nhân ……………………………………………………….75
3.19. Tải lượng HBV DNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu ……………..76
3.20. Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với các chỉ tiêu nghiên cứu
chung cả hai nhóm …………………………………………………………………..77
3.21. Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với các chỉ tiêu nghiên cứu
ở nhóm VGBMT……………………………………………………………………..78
3.22. Đặc điểm tải lượng HBV DNA theo mức tổn thương gan và mức xơ
hóa gan ở nhóm VGBMT. ………………………………………………………..79
3.23. Giá trị của cccDNA, HBV DNA, HBV RNA phân theo tình trạng
HBeAg ở nhóm VGBMT………………………………………………………….80
3.24. Đặc điểm nồng độ cccDNA theo tải lượng HBV DNA huyết tương ở
chung hai nhóm bệnh nhân ……………………………………………………….81Bảng Tên bảng Trang
3.25. Tương quan giữa cccDNA với HBV DNA theo một số chỉ tiêu
nghiên cứu ở hai nhóm …………………………………………………………….83
3.26. Nồng độ cccDNA với mức HBV RNA ở hai nhóm nghiên cứu ………..84
3.27. Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết
tương theo các chỉ tiêu nghiên cứuở hai nhóm nghiên cứu ………………86
3.28. Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với nồng độ HBV RNA
huyết tương ở các bệnh nhân nghiên cứu ……………………………………86
3.29. Tương quan giữa tải lượng HBV DNA với HBV RNA huyết tương
theo các chỉ tiêu nghiên cứu ở hai nhóm …………………………………….88DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ Tên biểu đồ Trang
3.1. Nồng độ cccDNA tế bào gan ở các hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu .. 68
3.2. Giá trị của cccDNA tế bào gan, HBV RNA và HBV DNA huyết tương
với tình trạng HBeAg ở nhóm VGBMT ………………………………………. 79
3.3. Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA
huyết tương ở chung hai nhóm……………………………………………………. 82
3.4. Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA
huyết tương ở nhóm VGBMT và xơ gan ……………………………………… 82
3.5. Tương quan giữa cccDNA với HBV RNA ở chung hai nhóm bệnh nhân
nghiên cứu ………………………………………………………………………………. 85
3.6. Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết
tương ở nhóm VGBMT và Xơ gan ……………………………………………… 85
3.7. Tương quan giữa HBV RNA và HBV DNA ở chung hai nhóm ………. 87
3.8. Tương quan giữa HBV RNA và HBV DNA ở nhóm VGBMT và xơ
gan ………………………………………………………………………………………….. 87
3.9. Tương quan giữa HBV RNA kết hợp với HBV DNA với cccDNA ở
chung hai nhóm ………………………………………………………………………… 88
3.10. Tương quan giữa HBV RNA kết hợp với HBV DNA với cccDNA ở
nhóm VGBMT và xơ gan…………………………………………………………… 89DANH MỤC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1. Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới………………………………………………. 3
1.2. Vòng đời của HBV và chu trình sinh học của cccDNA ……………………. 5
1.3. Phân loại giai đoạn nhiễm HBV ……………………………………………………. 8
1.4. Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA ……………………………………… 19
2.1. Mảnh gan thực tế sinh thiết…………………………………………………………. 43
2.2. Cấu trúc của cccDNA và rcDNA bộ gen của HBV………………………… 47
2.3. Bộ kit QIAamp Viral RNA mini kit ……………………………………………. 51
2.4. Sơ đồ vị trí thiết kế mồi của phản ứng định lượng HBV RNA ………… 53
2.5. Quy trình Onestep-RT PCR phát hiện chọn lọc HBV pgRNA ………… 5