Nghiên cứu sự biểu hiện của protein sửa lỗi bắt cặp sai trong carcinôm tuyến đại trực tràng

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu sự biểu hiện của protein sửa lỗi bắt cặp sai trong carcinôm tuyến đại trực tràng tại Bệnh viện Ung Bướu Thành phố Cần Thơ. Ung thư đại trực tràng (ĐTT) là một trong những gánh nặng ung thư lớn nhất toàn cầu. Theo GLOBOCAN 2022, có 1.926.118 ca mới mắc và 903.859 ca tử vong mỗi năm, xếp vị trí thứ ba về tần suất và thứ hai về tử vong do ung thư [1]. Tại Việt Nam, năm 2022 ghi nhận 16.835 ca mới mắc và 9.714 ca tử vong, đứng hàng thứ tư trong các ung thư thường gặp [1]. Phần lớn bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn muộn dẫn đến tỉ lệ sống còn thấp và gánh nặng y tế ngày càng gia tăng. Thực trạng này đòi hỏi việc xác định các dấu ấn sinh học có giá trị tiên lượng và định hướng điều trị chính xác hơn.
Về mô bệnh học, carcinôm tuyến ĐTT là loại mô học chiếm đa số trong ung thư ĐTT, và do đó là đối tượng chính cho nghiên cứu tiên lượng và điều trị. Một đột phá quan trọng trong sinh học phân tử carcinôm tuyến ĐTT là vai trò của hệ thống sửa lỗi bắt cặp sai DNA (mismatch repair – MMR), gồm bốn protein chính MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, có chức năng nhận diện và sửa chữa các lỗi bắt cặp sai trong quá trình sao chép DNA, qua đó duy trì tính ổn định bộ gen [2,3]. Khi một hoặc nhiều protein này mất biểu hiện (thiếu hụt sửa lỗi bắt cặp sai – dMMR), tế bào sẽ tích lũy đột biến tại các vùng vi vệ tinh và hình thành kiểu hình bất ổn định vi vệ tinh (MSIH). Tình trạng dMMR/MSI-H chiếm khoảng 15 – 20% carcinôm tuyến ĐTT thể ngẫu nhiên và mang ý nghĩa lâm sàng: tiên lượng tốt ở giai đoạn II, kém đáp ứng với hóa trị 5-fluorouracil (5-FU), nhưng đáp ứng tốt với liệu pháp ức chế điểm kiểm soát miễn dịch đã được FDA chấp thuận cho carcinôm tuyến ĐTT di căn [4,5]. Ngoài ra, phát hiện dMMR còn có vai trò sàng lọc hội chứng Lynch – bệnh ung thư di truyền phổ biến nhất liên quan đến carcinôm tuyến ĐTT [6].

Để phát hiện dMMR/MSI-H, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là nhuộm hóa mô miễn dịch (HMMD). HMMD đánh giá biểu hiện của bốn protein, có ưu điểm dễ triển khai, chi phí hợp lý [7,8], nhưng có thể bỏ sót những đột biến điểm không ảnh hưởng đến biểu hiện protein. Kỹ thuật ddPCR phát hiện bất ổn định vi vệ tinh ở mức phân tử với độ chính xác cao, đặc biệt phù hợp khi lượng DNA hạn chế [9,10]. Đánh giá mức độ tương hợp giữa hai phương pháp có ý nghĩa thiết thực: mức2 tương hợp cao cho phép dùng HMMD như công cụ sàng lọc tuyến đầu; ngược lại, ddPCR cần được tích hợp để xác nhận, tránh bỏ sót bệnh nhân có khả năng hưởng lợi từ liệu pháp miễn dịch.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về MMR trong carcinôm tuyến ĐTT còn ít và chưa thống nhất. Hầu hết các nghiên cứu chỉ sử dụng HMMD đơn độc; chưa có công trình nào phối hợp HMMD với ddPCR để đánh giá mức tương hợp giữa hai phương pháp. Tỉ lệ bất ổn định vi vệ tinh xác định bằng kỹ thuật ddPCR và tỉ lệ mất biểu hiện protein MMR xác định bằng kỹ thuật HMMD trong carcinôm tuyến ĐTT là bao nhiêu và mức độ tương hợp giữa hai phương pháp như thế nào? Dữ liệu về giá trị tiên lượng sống còn theo tình trạng MMR trong quần thể bệnh nhân Việt Nam cũng còn rất hạn chế. Giải quyết được các vấn đề trên sẽ cung cấp thêm dữ liệu tham chiếu về tỉ lệ dMMR ở Việt Nam, làm rõ mức tương hợp HMMD – ddPCR để hỗ trợ lựa chọn phương pháp xét nghiệm phù hợp điều kiện cơ sở y tế, đồng thời cung cấp bằng chứng về giá trị tiên lượng sống còn và mối liên quan mô bệnh học của dMMR, phục vụ sàng lọc hội chứng Lynch và chỉ định điều trị cá thể hóa cho bệnh nhân carcinôm tuyến ĐTT tại Việt Nam.
Xuất phát từ những khoảng trống đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: "Nghiên cứu sự biểu hiện của protein sửa lỗi bắt cặp sai trong carcinôm tuyến đại trực tràng" tại Bệnh viện Ung Bướu Thành phố Cần Thơ, với ba mục tiêu:
1. Xác định tỉ lệ bất ổn định vi vệ tinh bằng kỹ thuật ddPCR, tỉ lệ mất biểu hiện protein bằng kỹ thuật HMMD và mức độ tương hợp giữa hai phương pháp trong carcinôm tuyến ĐTT.
2. Khảo sát mối liên quan giữa mất biểu hiện protein MMR với các yếu tố lâm sàng và đặc điểm mô bệnh học trong carcinôm tuyến ĐTT.
3. So sánh thời gian sống còn không bệnh và thời gian sống còn toàn bộ giữa nhóm mất biểu hiện protein MMR và nhóm có biểu hiện protein MMR tại thời điểm 42 tháng trong carcinôm tuyến ĐTT

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………………………… I
LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………………. II
MỤC LỤC…………………………………………………………………………………………………III
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………………………………………………………….V
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………………. IX
DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………………………………………….. XI
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ…………………………………………………………………..XIII
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………3
1.1 Cơ sở sinh học phân tử của carcinôm tuyến đại trực tràng……………………………..3
1.2 Các con đường sinh ung thư chính………………………………………………………………7
1.3 Tổng quan về gen và protein sửa lỗi bắt cặp sai ………………………………………….10
1.4 Các phương pháp phát hiện tình trạng biểu hiện MMR………………………………..16
1.5 Bệnh học carcinôm tuyến đại trực tràng …………………………………………………….20
1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước …………………………………………………27
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….31
2.1 Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………………………31
2.2 Đối tượng ………………………………………………………………………………………………31
2.3 Cỡ mẫu ………………………………………………………………………………………………….32
2.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………………………………..33
2.5 Phương pháp thu thập và đo lường số liệu………………………………………………….34
2.6 Quy trình thu thập và phân tích số liệu ………………………………………………………48
2.7 Quy trình nghiên cứu ………………………………………………………………………………50
2.8 Phương pháp phân tích số liệu ………………………………………………………………….51
2.9 Đạo đức trong nghiên cứu………………………………………………………………………..52
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………..54
3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu…………………………………………………54iv
3.2 Tình trạng biểu hiện của protein MMR, mức độ tương hợp giữa hóa mô miễn dịch
với ddPCR …………………………………………………………………………………………………..57
3.3 Mối liên quan giữa mất biểu hiện protein MMR với các yếu tố lâm sàng và đặc
điểm mô bệnh học ………………………………………………………………………………………..59
3.4 So sánh thời gian sống còn không bệnh và thời gian sống còn toàn bộ theo tình
trạng MMR………………………………………………………………………………………………….72
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN …………………………………………………………………………..75
4.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu…………………………….…75
4.2 Tình trạng biểu hiện của protein MMR, mức độ tương hợp giữa hóa mô miễn dịch
với ddPCR …………………………………………………………………………………………………..82
4.3 Mối liên quan giữa mất biểu hiện protein MMR với các yếu tố lâm sàng và đặc
điểm mô bệnh học ………………………………………………………………………………………..90
4.4 So sánh thời gian sống còn không bệnh và thời gian sống còn toàn bộ theo tình
trạng MMR………………………………………………………………………………………………..108
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………………116
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………………..
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC 1……………………………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC 2……………………………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC 3……………………………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC 4……………………………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC 5…………………………………………………………………………………………………..

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại TNM carcinôm tuyến ĐTT theo AJCC/UICC phiên bản 8 ……25
Bảng 1.2. Phân loại giai đoạn carcinôm tuyến ĐTT theo AJCC/UICC phiên bản 8 26
Bảng 2.1. Chương trình luân nhiệt PCR ………………………………………………………….47
Bảng 3.1. Loại mô học, độ mô học, vị trí u và kích thước u……………………………….55
Bảng 3.2. Phân bố xâm lấn u, di căn hạch và giai đoạn TNM…………………………….56
Bảng 3.3. Phân bố tình trạng LVI, PNI và TILs………………………………………………..57
Bảng 3.4. Tỉ lệ mất biểu hiện protein MMR…………………………………………………….57
Bảng 3.5. Tương hợp giữa HMMD và ddPCR …………………………………………………59
Bảng 3.6. Mối liên quan giữa dMMR với tuổi và giới ………………………………………59
Bảng 3.7. Mối liên quan giữa mất biểu hiện protein MMR với loại mô học, độ mô
học, vị trí và kích thước u ……………………………………………………………………………..60
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa dMMR với pT và pTNM…………………………………….61
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa dMMR với di căn hạch, LVI, PNI và TILs ……………62
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MLH1 với loại mô học, độ mô học, vị
trí u và kích thước u ……………………………………………………………………………………..63
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MLH1 với pT, pN và pTNM …………64
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MLH1 với LVI, PNI và TILs ………..64
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH2 với loại mô học, độ mô học, vị
trí u và kích thước u ……………………………………………………………………………………..65
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH2 với pT, pN và pTNM …………66
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH2 với LVI, PNI và TILs…………67
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH6 với loại mô học, độ mô học, vị
trí u và kích thước u ……………………………………………………………………………………..67
Bảng 3.17. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH6 với pT, pN và pTNM …………68
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa mất biểu hiện MSH6 với LVI, PNI và TILs…………69
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa mất biểu hiện PMS2 với loại mô học, độ mô học, vị trí
u và kích thước u………………………………………………………………………………………….70x
Bảng 3.20. Mối liên quan giữa mất biểu hiện PMS2 với pT, pN và pTNM………….71
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa mất biểu hiện PMS2 với LVI, PNI và TILs …………71
Bảng 4.1. So sánh tỉ lệ mất biểu hiện MMR ở các nghiên cứu……………………………82
Bảng 4.2. So sánh tỉ lệ mất biểu hiện các protein MMR ở các nghiên cứu…………..84
Bảng 4.3. Tỉ lệ mất biểu hiện cặp protein MMR ở các nghiên cứu ……………………..85
Bảng 4.4. Tương hợp giữa nhuộm HMMD và ddPCR ………………………………………8

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế sửa lỗi bắt cặp sai………………………………………………………………..13
Hình 1.2. Tổn thương thể sùi …………………………………………………………………………21
Hình 1.3. Tổn thương thể loét ………………………………………………………………………..21
Hình 1.4. Tổn thương thể thâm nhiễm …………………………………………………………….22
Hình 1.5. Carcinôm tuyến không chế nhầy………………………………………………………22
Hình 1.6. Carcinôm tuyến chế nhầy………………………………………………………………..23
Hình 1.7. Carcinôm dạng tế bào nhẫn……………………………………………………………..23
Hình 1.8. Carcinôm dạng tủy …………………………………………………………………………24
Hình 1.9. Carcinôm không biệt hóa ………………………………………………………………..24
Hình 1.10. Độ biệt hóa của carcinôm tuyến đại trực tràng …………………………………25
Hình 2.1. Máy nhuộm HMMD tự động VENTANA …………………………………………40
Hình 2.2. Kết quả nhuộm HMMD ………………………………………………………………….43
Hình 2.3. Thiết kế đầu dò trong ddPCR phát hiện MSI……………………………………..44
Hình 2.4. Máy tạo vi giọt ………………………………………………………………………………45
Hình 2.5. Máy ép nhiệt dán đĩa………………………………………………………………………46
Hình 2.6. Máy luân nhiệt PCR……………………………………………………………………….46
Hình 2.7. Máy đọc kết quả QX200 Droplet Reader…………………………………………..47
Hình 2.8. Nguyên lý phát hiện MSI bằng ddPCR……………………………………………..4