Đánh giá kết quả tái tạo tổn thương sụn khớp sau chấn thương bằng tế bào gốc trung mô đồng loại nuôi cấy từ mô mỡ trên động vật thực nghiệm

Luận án tiến sĩ y học Đánh giá kết quả tái tạo tổn thương sụn khớp sau chấn thương bằng tế bào gốc trung mô đồng loại nuôi cấy từ mô mỡ trên động vật thực nghiệm. Tổn thương sụn khớp là bệnh lý phổ biến trên lâm sàng, gây ra tình trạng đau mạn tính và các rối loạn vận động. Ngoài ra, tổn thương sụn khớp là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tàn phế [1]. Theo thống kê năm 2023, có khoảng 595 triệu người tương đương 7,6% dân số thế giới mắc bệnh thoái hoá khớp [2]. Trong số những người bệnh có triệu chứng, 80% có hạn chế khả năng vận động và 25% không thể thực hiện các hoạt động hàng ngày của họ [3]. Với các tổn thương sụn ở giai đoạn cấp tính, nếu không được điều trị kịp thời sẽ dẫn đến thoái hoá khớp (THK). Do đó, nhu cầu đặt ra là cần có biện pháp điều trị sớm sau khi mô sụn bị chấn thương để hạn chế sự tiến triển của bệnh [4].
Mặc dù có rất nhiều tiến bộ về điều trị các bệnh lý khớp trong vài thập kỷ gần đây nhưng vấn đề tái tạo lại sụn khớp bị tổn thương vẫn đang là một thách thức đối với các bác sĩ chỉnh hình. Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay chưa có kỹ thuật nào đang được sử dụng trên lâm sàng có thể tái tạo hoàn toàn sụn khớp [5, 6], [7]. Các phương pháp điều trị bệnh lý tổn thương sụn khớp hiện tại chưa thực sự đi vào phục hồi lại lớp sụn tổn thương mà chỉ làm giảm tạm thời các triệu chứng [8]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng cho thấy liệu pháp liên quan đến tế bào gốc trung mô (TBGTM) là một lựa chọn đầy hứa hẹn để điều trị các tổn thương sụn và THK.

Nguồn TBGTM lấy từ tủy xương đã được nghiên cứu khá nhiều trong các mô hình động vật và thử nghiệm lâm sàng để chứng minh tiềm năng tạo sụn của chúng, tuy nhiên số lượng tế bào thu được thấp, thủ thuật có mức độ can thiệp lớn. Một nguồn mới dễ tiếp cận là TBGTM có nguồn gốc từ mô mỡ có thể thu nhận số lượng tế bào lớn hơn và là một can thiệp ít xâm lấn [9].
Hai phương pháp điều trị tổn thương sụn và thoái hoá khớp có liên quan với TBGTM hiện nay là kỹ thuật cấy ghép và tiêm TBGTM tại khớp [9]; theo quy trình, trước khi áp dụng trong lâm sàng, giai đoạn nghiên cứu trên động vật là điều bắt buộc [10]. Trên thực tế, việc áp dụng chúng trên lâm sàng còn hạn chế mặc dù đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng được thông báo trong y văn. Lý do là bởi các kết quả của các nghiên cứu chưa đồng nhất [11, 12]; cơ chế, mức độ2 tích hợp và chất lượng của mô sụn mới hình thành cũng chưa được giải thích thỏa đáng. Bên cạnh đó, mặc dù đã nghiên cứu trên rất nhiều loại TBG có nguồn gốc khác nhau, nhưng cơ chế cũng như ảnh hưởng như thế nào đến mức độ tích hợp của sụn tự nhiên và sụn cấy ghép cũng như chất lượng của sụn mới hình thành cũng chưa được giải thích thỏa đáng [4].
Các nghiên cứu tiền lâm sàng trên động vật là rất quan trọng để tìm ra phương pháp điều trị hiệu quả phục hồi sụn khớp bị tổn thương. Việc nghiên cứu trên các mô hình nhóm động vật nhỏ như chuột, thỏ tuy tiết kiệm về kinh phí, dễ nuôi, nhưng có nhược điểm là kích thước khớp nhỏ, sụn mỏng và khả năng tự tái tạo cao hơn con người.
Nhóm linh trưởng, được cho là có cấu tạo về sụn khớp và chức năng gần giống nhất với con người hơn cả, nhưng khi triển khai nghiên cứu lại vướng mắc về tài chính và đạo đức nghiên cứu [13]. Nghiên cứu trên mô hình chó có tổn thương sụn khớp được đánh giá là thích hợp vì tuổi thọ loài chó cao, bản thân chúng cũng bị thoái hoá sụn khớp nguyên phát và khả năng tự tái tạo sụn cũng hạn chế giống như con người. Do đó, các nghiên cứu về tái tạo sụn ở nhóm động vật này có ý nghĩa lâm sàng và độ tương đồng khá cao so với tổn thương sụn khớp trên người [13, 14]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có sự thống nhất chung về đặc điểm của TBGTM trên chó, nguồn tế bào, liều tế bào, cách sử dụng, thời gian
nghiên cứu cũng như phương pháp đánh giá kết quả [15-17].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu thực nghiệm về TBGTM được tiến hành chủ yếu trên loài chuột, thỏ [18-20]. Cho đến nay chúng tôi chưa tìm thấy nghiên cứu nào về TBGTM từ mô mỡ trên chó.
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá kết quả tái tạo tổn thương sụn khớp sau chấn thương bằng tế bào gốc trung mô đồng loại nuôi cấy từ mô mỡ trên động vật thực nghiệm” với 2 mục tiêu:
1. Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trên chó và đánh giá đặc điểm tế bào sau nuôi cấy.
2. Đánh giá khả năng hỗ trợ tái tạo sụn khớp của tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy từ mô mỡ trên chó

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………………………… 1
Chương 1: TỔNG QUAN ………………………………………………………………………. 3
1.1. Tổn thương sụn khớp ……………………………………………………………………………..3
1.1.1. Đặc điểm tổn thương sụn khớp……………………………………………………….. 3
1.1.2. Một số phương pháp điều trị tổn thương sụn khớp hiện nay ………………… 6
1.2 . Tế bào gốc trung mô ……………………………………………………………………………11
1.3. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ………………………………………………………………13
1.3.1 Đặc điểm tế bào gốc trung mô từ mô mỡ…………………………………………. 13
1.3.2. Dấu ấn định danh của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ……………………….. 15
1.3.3. Tiềm năng tái tạo sụn của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ………………….. 17
1.4. Nghiên cứu về tác dụng của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ điều trị tổn thương
sụn khớp……………………………………………………………………………………………………20
1.4.1 Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên thế giới …………………………………. 20
1.4.2. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tại Việt Nam ……………………………….. 22
1.4.3. Nghiên cứu điều trị tổn thương sụn khớp trên mô hình động vật ………… 24
1.5. Những thách thức đặt ra và những khoảng trống trong nghiên cứu……………..32
1.5.1. Những thách thức hiện nay…………………………………………………………… 32
1.5.2 Những khoảng trống trong nghiên cứu tái tạo sụn khớp hiện nay ………… 33
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………… 35
2.1. Thiết kế nghiên cứu:……………………………………………………………………………..35
2.1.1. Sơ đồ nghiên cứu………………………………………………………………………… 35
2.1.2. Động vật nghiên cứu……………………………………………………………………. 35
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………….. 36
2.2. Lấy mô mỡ, phân lập và nuôi cấy TBGTM trong môi trường In vitro. …… 37
2.2.1. Động vật:…………………………………………………………………………………… 37
2.2.3. Phẫu thuật lấy mô mỡ:…………………………………………………………………. 37
2.2.4. Trang thiết bị và hoá chất, vật tư …………………………………………………… 37
2.2.4.1. Trang thiết bị…………………………………………………………………………… 372.2.4.2. Hóa chất, vật tư ……………………………………………………………………….. 38
2.3. Nghiên cứu trên in vivo…………………………………………………………………………41
2.3.1. Động vật:…………………………………………………………………………………… 41
2.3.2. Vô cảm:…………………………………………………………………………………….. 41
2.3.3. Phương pháp phẫu thuật và tạo tổn thương sụn khớp………………………… 42
2.4. Đạo đức nghiên cứu ……………………………………………………………………………..50
2.5. Xử lý số liệu ………………………………………………………………………………………..50
Chương 3 …………………………………………………………………………………………… 51
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………………………. 51
3.1. Kết quả nghiên cứu trên in vitro……………………………………………………………..51
3.1.1. Kết quả thu thập mô mỡs……………………………………………………………… 51
3.1.2. Phân lập và nuôi cấy sơ cấp………………………………………………………….. 52
3.1.3 Nuôi cấy thứ cấp và đánh giá…………………………………………………………. 54
3.1.4. Chia liều tế bào gốc trung mô từ mô mỡ…………………………………………. 57
3.2. Kết quả nghiên cứu trên in vivo ……………………………………………………………..59
3.2.1. Một số đặc điểm của nhóm động vật nghiên cứu ……………………………… 59
3.2.2. Kết quả chụp cộng hưởng từ…………………………………………………………. 61
3.2.3 Quan sát đại thể…………………………………………………………………………… 65
3.2.4 Kết quả phân tích mô bệnh học………………………………………………………. 67
3.3. Mối tương quan giữa các chỉ tiêu cận lâm sàng ………………………………….. 76
Chương 4: BÀN LUẬN ……………………………………………………………………….. 77
4.1. Nghiên cứu trên In vitro. ……………………………………………………………………….77
4.2. Nghiên cứu trên In vivo ………………………………………………………………………..79
4.2.1. Kết quả tạo tổn thương sụn trên ĐVTN………………………………………………..79
4.2.1.1. Lựa chọn mô hình thực nghiệm trên loài chó:……………………………….. 79
4.2.1.2. Mô hình tạo tổn thương sụn khớp:………………………………………………. 80
4.2.1.3. Loài động vật nghiên cứu ………………………………………………………….. 82
4.2.1.4. Nguồn tế bào gốc trung mô………………………………………………………… 83
4.2.1.5. Thời gian tiêm, đường tiêm và liều TBGTM sử dụng …………………….. 84
4.2.2. Kết quả chụp cộng hưởng từ…………………………………………………………. 864.2.3. Kết quả chấm điểm đại thể …………………………………………………………… 90
4.2.4. Kết quả chấm điểm mô bệnh học…………………………………………………… 92
4.2.5. Kết quả mối tương quan giữa các chỉ tiêu đánh giá cận lâm sàng ……….. 98
4.3. Tiềm năng ứng dụng trên lâm sàng……………………………………………………….100
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………………. 104
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………………..

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Minh hoạ tổn thương sụn khớp ………………………………………………….. 3
Hình 1.2. Minh hoạ phân loại tổn thương sụn khớp theo Outerbridge. …………… 5
Hình 1.3: Minh họa kỹ thuật gãy xương vi mô …………………………………………… 7
Hình 1.4: Kỹ thuật ghép sụn mosaicplasty…………………………………………………. 8
Hình 1.5: Kỹ thuật ghép sụn tự thân ……………………………………………………….. 10
Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thu nhận từ mô mỡ…………………… 15
Hình 1.7: Minh họa hai giả thuyết về tái tạo sụn khớp liên quan đến TBG…………. 18
Hình 1.8: Mô hình tạo rãnh Groove………………………………………………………… 27
Hình 1.9: Mô hình tổn thương sụn và xương dưới sụn ở chó………………………. 27
Hình 1.10: Tổn thương khuyết sụn cấp tính đường kính 4mm…………………….. 28
Hình 1.11: Minh họa, chụp MRI đánh giá sau điều trị……………………………….. 29
Hình 1.12: Minh họa, nhuộm HE mô bệnh học đánh giá sau điều trị ở 3 nhóm……. 30
Hình 1.13: Minh hoạ chấm điểm đại thể tái tạo sụn theo Outerbridge ………….. 31
Hình 1.14: Những khoảng trống trong nghiên cứu quá trình tái tạo sụn khớp… 33
Hình 1.15: Các phương pháp điều trị và ý tưởng trong chấn thương sụn khớp . 34
Hình 2.1: Quá trình chuẩn bị ĐV trước mổ ……………………………………………… 36
Hình 2.2. Bộ mồi realtime PCR đánh giá biểu hiện marker bề mặt đặc trưng của MSC… 41
Hình 2.3: Tiêm nội khớp dưới hướng dẫn của siêu âm, khớp số 4 ……………….. 43
Hình 2.4: Tư thế động vật trên bàn mổ và thứ tự đánh số các khớp trước khi tiêm……….. 44
Hình 2.5: Các liều tiêm TBG và giả dược………………………………………………… 44
Hình 2.6: Quá trình đánh giá kết quả sau thí nghiệm …………………………………. 45
Hình 2.7: Các mẫu chi được bọc Nylon kín, chuẩn bị trước khi chụp MRI……. 46
Hình 2.8: Minh hoạ tổn thương khớp trên phim MRI ………………………………… 47
Hình 2.9: Mở khớp quan sát đại thể………………………………………………………… 48
Hình 2.10: Quá trình lấy mẫu mô làm giải phẫu bệnh………………………………… 48
Hình 2.11: Minh hoạ chấm điểm tổn thương sụn theo OARSI ……………………. 49
Hình 3.1. Quy trình phẫu thuật thu thập mô mỡ………………………………………… 51
Hình 3.2. Quy trình phân lập, nuôi cấy sơ cấp TBGTM từ mô mỡ ………………. 52Hình 3.3. Kết quả phân lập TBGTM từ các mô mỡ khác nhau ……………………. 53
Hình 3.4. Đánh giá thời gian nhân đôi trong quá trình phân lập và nuôi cấy
TBGTM từ mô mỡ tại các vị trí khác nhau………………………………………………. 55
Hình 3.5. Các phương pháp đánh giá đặc điểm và chất lượng tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ trên chó ………………………………………………………………………….. 57
Hình 3.6: Kết quả tạo tổn thương sụn khớp ……………………………………………… 61
Hình 3.7. Đọc và phân tích kết quả chụp MRI trên mDICOM viewer ………….. 63
Hình 3.8: Tổn thương viêm màng hoạt dịch, gai xương trên MRI ………………. 64
Hình 3.9: Minh họa chấm điểm ICRS đại thể, ĐV013 chân số 3…………………. 66
Hình 3.10 : Mở khớp quan sát đại thể……………………………………………………… 67
Hình 3.11. Chấm điểm tidemark, tiêu bản mã số ĐV ………………………………… 69
Hình 3.12. Phân tích mô bệnh học trên tiêu bản nhuộm HE và Safranin O……. 70
Hình 3.13. Phân tích mô bệnh học trên tiêu bản nhuộm hoá mô – Safranin O… 70
Hình 3.14. Mô bệnh học ĐV006-4 trên tiêu bản nhuộm HE (ảnh trái) và
Safranin O………………………………………………………………………………………….. 72
Hình 4.1: Minh hoạ lập T2 map sụn khớp gối ………………………………………….. 86
Hình 4.2. Minh hoạ chấm điểm theo MOCART2.0 …………………………………… 87
Hình 4.3: Các hệ thống tính điểm mô học sụn ………………………………………….. 93
Hình 4.4: Khuyến cáo lựa chọn các hệ thống tính điểm mô học tái tạo sụn …… 9