NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN MAO-B NGƯỜI TÁI TỔ HỢP – ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ MAO-B

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN MAO-B NGƯỜI TÁI TỔ HỢP – ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ MAO-B.Các rối loạn thoái hóa thần kinh, đặc biệt là bệnh Alzheimer (AD) và bệnh Parkinson (PD), hiện là gánh nặng sức khỏe toàn cầu đáng kể, với tỷ lệ mắc tăng nhanh do vấn đề già hóa dân số. Bệnh Parkinson, đặc trưng bởi sự mất dần các tế bào thần kinh dopaminergic ở thể vân, dẫn đến các triệu chứng vận động nghiêm trọng như run, cứng cơ và chậm vận động. Monoamine oxidase B (MAO-B), một enzym thuộc họ flavoprotein, đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa dopamin. Sự hoạt động quá mức của MAO-B không chỉ làm suy giảm nồng độ dopamin mà còn sản sinh ra các gốc oxy hóa tự do, gây stress oxy hóa và góp phần vào quá trình thoái hóa tế bào thần kinh. Do đó, ức chế chọn lọc MAO-B là một chiến lược điều trị hiệu quả, giúp bảo tồn dopamin và làm chậm tiến triển bệnh.

Hiện tại, chỉ có ba thuốc ức chế MAO-B chọn lọc (selegilin, rasagilin, safinamid) được FDA phê duyệt để điều trị Parkinson, cho thấy tốc độ phát triển thuốc mới trong lĩnh vực này còn rất chậm. Thách thức lớn nhất là việc tìm kiếm các ứng viên mới phải đối mặt với nguy cơ tác dụng phụ nghiêm trọng, nhất là "hội chứng phô mát" (tăng huyết áp) do khả năng ức chế không chọn lọc lên cả MAOA và MAO-B. Vì vậy, nghiên cứu phát triển các chất ức chế chuyên biệt chọn lọc trên MAO-B là mục tiêu cấp thiết của khoa học hiện nay. Tuy nhiên, việc sàng lọc hoạt tính in vitro trên các cơ sở dữ liệu lớn đòi hỏi kinh phí và thời gian rất lớn, đặc biệt trong điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam.
Nhằm giải quyết những thách thức trên, luận án tìm kiếm và phát triển các chất ức chế MAO-B tiềm năng. Thứ nhất, luận án thực hiện sàng lọc ảo (in silico) từ các ngân hàng dữ liệu lớn theo hai hướng: hướng truyền thống (docking, mô phỏng động lực học phân tử (MD), QSAR) để khảo sát sâu hơn sự gắn kết và tương tác và hướng áp dụng mô hình học sâu với mô hình mạng nơ-ron tích chập để xây dựng mô hình phân loại hoạt chất ức chế chọn lọc MAO-B. Thứ hai, để đảm bảo tính khả thi và độc lập của quy trình nghiên cứu, luận án sẽ giải quyết rào cản lớn về công cụ sinh học bằng cách biểu hiện enzym MAO-B người tái tổ hợp trên hệ thống biểu2 hiện Pichia pastoris. Việc tự chủ sản xuất enzym MAO-B có hoạt tính sinh học cao và ổn định là mục tiêu chiến lược, giúp thay thế các bộ kit enzym thương mại đắt tiền, tạo nền tảng vững chắc cho các thử nghiệm sinh học quy mô lớn trong nước.
Cuối cùng, các chất “hit” tiềm năng nhất từ quá trình sàng lọc ảo sẽ được tiến hành tổng hợp hóa học ở quy mô phòng thí nghiệm. Các chất đã tổng hợp sau đó sẽ được thử nghiệm tác dụng ức chế in vitro trên enzym MAO-B người tái tổ hợp.
Thông qua quy trình tích hợp từ tìm kiếm các chất tiềm năng trên cơ sở dữ liệu các hợp chất hóa học lớn trên thế giới (in silico) đến sinh học phân tử (biểu hiện enzym tái tổ hợp), tổng hợp hóa học và xác nhận hoạt tính (in vitro), luận án đặt mục tiêu thiết lập một chuỗi nghiên cứu hoàn chỉnh và hiệu quả, góp phần xác định các hợp chất ức chế MAO-B chọn lọc mới có tiềm năng phát triển thành thuốc điều trị bệnh
Parkinson.
Mục tiêu tổng quát:
Nghiên cứu tích hợp đa phương pháp (sàng lọc ảo, biểu hiện enzym tái tổ hợp, tổng hợp hóa học và thử nghiệm hoạt tính in vitro) để tìm kiếm, tổng hợp và xác nhận hoạt tính của các hợp chất ức chế chọn lọc MAO-B mới.
Mục tiêu cụ thể:
– Xây dựng và ứng dụng các mô hình (pharmacophore, QSAR, docking, MD, CNN) để tìm kiếm các chất ức chế MAO-B tiềm năng in silico.
– Khảo sát điều kiện biểu hiện và đánh giá hoạt tính enzym MAO-B người tái tổ hợp trên hệ thống Pichia pastoris.
– Tổng hợp các dẫn xuất tiềm năng từ kết quả sàng lọc và đánh giá hoạt tính ức chế MAO-B in vitro

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………………………… I
LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………………..II
MỤC LỤC…………………………………………………………………………………………………III
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ………………………………………………………………….VII
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………………XII
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ…………………………………………………………. XIV
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ……………………………………………………………………..3
1.1. Enzym monoamin oxidase và vai trò trong bệnh lý…………………………………….3
1.1.1. Khái quát về enzym monoamin oxidase (MAO) …………………………………………3
1.1.2. Cấu trúc enzym monoamin oxidase B (MAO-B) ………………………………………..4
1.1.3. Vai trò của enzym MAO-B và các bệnh lý liên quan…………………………………..7
1.1.4. Chất ức chế MAO-B và ứng dụng trong y học……………………………………………9
1.1.5. Thách thức và cơ hội trong nghiên cứu phát triển thuốc ức chế MAO-B mới .11
1.2. Phương pháp sàng lọc ảo và ứng dụng trí tuệ nhân tạo trong sàng lọc…………11
1.2.1. Khái niệm và vai trò của sàng lọc ảo ……………………………………………………….11
1.2.2. Mô phỏng động lực học phân tử ……………………………………………………………..17
1.2.3. Năng lượng tự do liên kết ………………………………………………………………………21
1.2.4. Ứng dụng học máy (machine learning) và học sâu (deep learning) trong phát
triển thuốc 22
1.2.5. Các cơ sở dữ liệu hóa học dùng trong sàng lọc …………………………………………24
1.3. Tái tổ hợp protein và hệ thống biểu hiện Pichia pastoris …………………………..27
1.3.1. Tái tổ hợp protein………………………………………………………………………………….27
1.3.2. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris…………………………………………………………..28
1.4. Đánh giá hoạt tính ức chế MAO-B in vitro………………………………………………32
1.5. Tổng hợp các nghiên cứu về enzym MAO-B và các chất ức chế ………………..34
1.5.1. Nền tảng cấu trúc enzym MAO-B người tái tổ hợp (2000–2022)………………..34
1.5.2. Các nghiên cứu áp dụng phương pháp sàng lọc ảo truyền thống (2012–2024) 35iv
1.5.3. Các nghiên cứu áp dụng phương pháp tích hợp trí tuệ nhân tạo và học máy
(2020–2024)………………………………………………………………………………………………………….36
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………..38
2.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………………………. 38
2.2. Dữ liệu và vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………………….38
2.2.1. Xây dựng mô hình sàng lọc ảo ……………………………………………………………….38
2.2.2. Biểu hiện MAO-B người tái tổ hợp …………………………………………………………40
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………..41
2.4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………………….41
2.4.1. Xây dựng các mô hình pharmacophore – 2D-QSAR – docking ………………….41
2.4.2. Xây dựng mô hình mạng nơ-ron tích chập (CNN) …………………………………….44
2.4.3. Xác định điều kiện biểu hiện và tinh sạch MAO-B người tái tổ hợp trên hệ
thống nấm men Pichia pastoris ………………………………………………………………………………..50
2.4.4. Phương pháp đo hoạt tính ức chế MAO-B và xác định IC50 in vitro của chất
tổng hợp ……………………………………………………………………………………………………………55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………59
3.1. Xây dựng mô hình sàng lọc ảo và áp dụng sàng lọc các chất ức chế MAO-B chọn
lọc trên các ngân hàng dữ liệu………………………………………………………………………..59
3.1.1. Mô hình 3D-pharmacophore…………………………………………………………………..59
3.1.2. Mô hình 2D-QSAR……………………………………………………………………………….61
3.1.3. Sàng lọc ADMET …………………………………………………………………………………63
3.1.4. Docking phân tử……………………………………………………………………………………64
3.1.5. Mô phỏng động lực học phân tử ……………………………………………………………..68
3.2. Ứng dụng mô hình mạng nơ-ron tích chập sàng lọc các chất ức chế MAO-B
chọn lọc ………………………………………………………………………………………………………71
3.2.1. Xây dựng và thẩm định mô hình phân loại CNN của các chất ức chế MAO-B
(Mô hình hoạt tính)………………………………………………………………………………………………..71
3.2.2. Xây dựng và thẩm định mô hình phân loại CNN của các chất ức chế MAO-B
chọn lọc (Mô hình chọn lọc)……………………………………………………………………………………72
3.2.3. Ứng dụng các mô hình CNN để sàng lọc và đánh giá ADMET…………………..74
3.2.4. Docking phân tử……………………………………………………………………………………74v
3.2.5. Mô phỏng động lực học phân tử ……………………………………………………………..77
3.3. Kiểm chứng chéo giữa 2 phương pháp sàng lọc ảo …………………………………..79
3.4. Tổng hợp các chất tiềm năng từ quá trình sàng lọc ảo……………………………….83
3.5. Khảo sát các yếu tố của quá trình biểu hiện enzym MAO-B người tái tổ hợp trên
hệ thống nấm men Pichia pastoris…………………………………………………………………..84
3.5.1. Khảo sát đường cong sinh trưởng của chủng Pichia pastoris mang gen MAO-B
tái tổ hợp ……………………………………………………………………………………………………………84
3.5.2. Khảo sát các điều kiện trong quá trình biểu hiện……………………………………….86
3.5.3. Biểu hiện và tinh sạch MAO-B người tái tổ hợp trên Pichia pastoris …………..90
3.6. Đánh giá tác dụng ức chế MAO-B in vitro của các chất tiềm năng được tổng
hợp Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN……………………………………………………………………..103
4.1. Sàng lọc in silico chất ức chế MAO-B chọn lọc ……………………………………..103
4.1.1. Hướng sàng lọc truyền thống………………………………………………………………..103
4.1.2. Hướng sàng lọc ứng dụng mô hình mạng nơ-ron tích chập (CNN) ……………108
4.2. Tối ưu hóa biểu hiện MAO-B người trên hệ nấm men Pichia pastoris………120
4.2.1. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris…………………………………………………………120
4.2.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và biểu hiện protein MAO-B………………………..122
4.2.3. Khảo sát điều kiện phá tế bào ……………………………………………………………….126
4.2.4. Tinh sạch MAO-B tái tổ hợp ………………………………………………………………..129
4.3. Tác dụng ức chế MAO-B in vitro của các chất tiềm năng được tổng hợp…..132
4.3.1. Các phát hiện chính của luận án ……………………………………………………………133
4.3.2. So sánh với các nghiên cứu khác …………………………………………………………..134
4.3.3. Phân tích mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính (SAR) …………………………………..136
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………..141
5.1. Kết luận …………………………………………………………………………………………….141
5.1.1. Sàng lọc và thiết kế hợp chất ức chế chọn lọc MAO-B…………………………….141
5.1.2. Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất sàng lọc …………..141
5.1.3. Biểu hiện và tinh sạch enzym MAO-B người tái tổ hợp …………………………..142
5.2. Kiến nghị …………………………………………………………………………………………..143vi
5.3. Đóng góp mới của luận án……………………………………………………………………143
5.3.1. Xây dựng các mô hình sàng lọc in silico ………………………………………………..143
5.3.2. Phát triển dữ liệu hóa học và các khung cấu trúc tiềm năng………………………144
5.3.3. Phát hiện hợp chất dẫn đầu vượt trội và làm rõ quy luật SAR …………………..144
5.3.4. Tự chủ công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp tại Việt Nam ……………………..144
5.3.5. Thiết lập quy trình nghiên cứu tích hợp khép kín…………………………………….144
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ………………………………………………..
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………………….

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các ví dụ về chất ức chế MAO-B và chỉ định chính trong điều trị hoặc tiềm
năng ứng dụng trong y học của các chất này [18]. ……………………………………………10
Bảng 1.2 Các loại liên kết hydro [44,45] …………………………………………………………21
Bảng 2.1. Các giá trị siêu tham số được khảo sát trong quá trình huấn luyện mô hình
CNN …………………………………………………………………………………………………………..47
Bảng 2.2. Thành phần mẫu thử hoạt tính MAO-B…………………………………………….55
Bảng 2.3. Thành phần thử nghiệm đo hoạt tính ức chế MAO-B in vitro ……………..57
Bảng 3.1. Đánh giá các mô hình 3D-pharmacophore………………………………………..61
Bảng 3.2. Mức độ tương quan của các thông số mô tả với nhau và với pIC50 ………61
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá mô hình 2D-QSAR……………………………………………….63
Bảng 3.4. Miền ứng dụng của mô hình 2D-QSAR……………………………………………63
Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc ADMET ………………………………………………………………64
Bảng 3.6. Kết quả docking vào MAO-B………………………………………………………….64
Bảng 3.7. Kết quả docking vào MAO-A …………………………………………………………65
Bảng 3.8. Cấu trúc của 22 chất được thực hiện mô phỏng động lực học phân tử ….66
Bảng 3.9. Liên kết hydro của 6 phức hợp protein – phối tử và safinamid…………….70
Bảng 3.10. Năng lượng liên kết tự do của 6 phối tử và safinamid ………………………71
Bảng 3.11. Kết quả thống kê của mô hình hoạt tính với các giá trị siêu tham số được
khảo sát……………………………………………………………………………………………………….72
Bảng 3.12. Kết quả thống kê của mô hình chọn lọc với các giá trị siêu tham số được
khảo sát……………………………………………………………………………………………………….73
Bảng 3.13. Kết quả docking của 7 hợp chất với MAO-B và MAO-A …………………75
Bảng 3.14. Kết quả sàng lọc chéo từ hướng CNN sang hướng truyền thống………..81
Bảng 3.15. Kết quả sàng lọc chéo từ hướng truyền thống sang hướng CNN………..81
Bảng 3.16. Các hợp chất thỏa cả 2 hướng sàng lọc …………………………………………..82
Bảng 3.17. Cấu trúc khởi nguồn và dẫn xuất từ các chất tiềm năng được tổng hợp 83xiii
Bảng 3.18. Sinh khối, nồng độ protein và hoạt tính enzym MAO-B tái tổ hợp trong
các môi trường và nồng độ chất methanol khảo sát…………………………………………..86
Bảng 3.19. Sinh khối, nồng độ protein và hoạt tính enzym MAO-B tái tổ hợp ở các
thời gian cảm ứng khác nhau …………………………………………………………………………88
Bảng 3.20. Nồng độ protein ở các điều kiện phá tế bào khảo sát ………………………..89
Bảng 3.21. Sinh khối của P. pastoris trong môi trường BMG và BMM………………90
Bảng 3.22. Bảng tổng hợp hiệu suất tinh sạch MAO-B qua các giai đoạn…………..93
Bảng 3.23. IC50 của các chất ức chế tiềm năng đã được tổng hợp và dẫn xuất của
chúng ………………………………………………………………………………………………………….95
Bảng 3.24. Khảo sát tác động ức chế của rasagilin lên hoạt tính enzym MAO-B …96
Bảng 3.25. Khảo sát tác động ức chế của G502-0026 lên hoạt tính enzym MAO-B
…………………………………………………………………………………………………………………..97
Bảng 3.26. Khảo sát tác động ức chế của dẫn xuất fluoro của G502-0026 lên hoạt tính
enzym MAO-B…………………………………………………………………………………………….98
Bảng 3.27. Khảo sát tác động ức chế của đồng phân amid của G502-0026 lên hoạt
tính enzym MAO-B………………………………………………………………………………………99
Bảng 3.28. Khảo sát tác động ức chế của G851-0627 lên hoạt tính enzym MAO-B
…………………………………………………………………………………………………………………100
Bảng 3.29. Khảo sát tác động ức chế của ZINC21285023 lên hoạt tính enzym MAOB ………………………………………………………………………………………………………………101
Bảng 4.1. Tóm tắt hoạt tính ức chế MAO-B của các hợp chất nghiên cứu …………132
Bảng 4.2. Hoạt tính ức chế MAO-B của G502-0026 trong mối tương quan với các
thuốc ức chế trên lâm sàng…………………………………………………………………………..135xiv
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu trúc MAO-B (mã PDB: 2V5Z) và MAO-A (mã PDB: 2Z5Y) và các
khoang gắn kết tương ứng……………………………………………………………………………….5
Hình 1.2 Vùng liên kết màng trong cấu trúc enzym MAO-B ở người …………………..6
Hình 1.3 Quá trình dopamin bị chuyển hóa bởi MAO ………………………………………..8
Hình 1.4. Cấu trúc mô hình học sâu CNN. ………………………………………………………24
Hình 1.5 Phản ứng kết hợp aldehyd dehydrogenase của monoamin oxydase……….33
Hình 1.6 Phản ứng oxy hóa dưới sự hiện diện của peroxydase…………………………..33
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu………………………………………………………………39
Hình 2.2. Bốn khung cấu trúc được sử dụng để tạo mô hình 3D-pharmacophore dựa
trên phối tử ………………………………………………………………………………………………….42
Hình 3.1. Các mô hình pharmacophore S01, S02, S03 được xây dựng dựa trên cấu
trúc protein và cách thức liên kết với phối tử safinamid…………………………………….59
Hình 3.2. Các mô hình pharmacophore L01, L02, L03, L04 được xây dựng dựa trên
4 chất của tập xây dựng…………………………………………………………………………………60
Hình 3.3. Kết quả sàng lọc bằng mô hình 3D-pharmacophore L04 …………………….61
Hình 3.4. RMSD của protein MAO-B tự do và 6 phức hợp protein-phối tử và
safinamid …………………………………………………………………………………………………….68
Hình 3.5. Bán kính quay (Rg) của protein MAO-B tự do và 6 phức hợp protein – phối
tử và safinamid…………………………………………………………………………………………….69
Hình 3.6. RMSF của các acid amin trong protein MAO-B tự do và 6 phức hợp
protein-phối tử và safinamid ………………………………………………………………………….70
Hình 3.7. Kết quả của quá trình sàng lọc ảo áp dụng các mô hình CNN ……………..74
Hình 3.8. RMSD của 7 hợp chất và safinamid trong phức hợp với enzym MAO-B
(Hình A) và enzym MAO-A (Hình B) trong quá trình mô phỏng động học phân tử.
…………………………………………………………………………………………………………………..78xv
Hình 3.9. RMSF của 7 hợp chất và safinamid trong phức hợp với enzym MAO-B
(Hình A) và enzym MAO-A (Hình B) trong quá trình mô phỏng động lực học phân
tử………………………………………………………………………………………………………………..79
Hình 3.10. Bán kính quay (Rg) của 7 hợp chất và safinamid trong phức hợp với enzym
MAO-B trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử. …………………………………80
Hình 3.11. Mô hình BOILED-Egg………………………………………………………………….80
Hình 3.12. Đường cong sinh trưởng nấm men P. pastoris tính theo OD600 ………….85
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS – PAGE các phân đoạn tinh sạch MAO-B…………91
Hình 3.14. Kết quả phân tích Western blot của enzym MAO-B người tái tổ hợp sau
tinh sạch ……………………………………………………………………………………………………..93
Hình 3.15. Sơ đồ biểu hiện, tinh sạch vào đánh giá hoạt tính MAO-B người tái tổ hợp
trên Pichia pastoris ………………………………………………………………………………………96
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự ức chế MAO-B theo nồng độ rasagilin ……………….97
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự ức chế MAO-B theo nồng độ G502-0026……………98
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự ức chế MAO-B theo nồng độ dẫn xuất fluoro của
G502-0026…………………………………………………………………………………………………..99
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn sự ức chế MAO-B theo nồng độ G851-0627………….101
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự ức chế MAO-B theo nồng độ ZINC21285023……102
Hình 4.1. Mô phỏng gắn kết của G502-0026 và T226-1029 vào MAO-B và MAO-A
…………………………………………………………………………………………………………………111
Hình 4.2. Mô phỏng gắn kết của P680-0565, V014-9312, G851-0627 vào MAO-B và
MAO-A …………………………………………………………………………………………………….113
Hình 4.3. Mô phỏng gắn kết của P680-0058, P680-0093 vào MAO-B và MAO-A
…………………………………………………………………………………………………………………114
Hình 4.4. Mối quan hệ cấu trúc-tác dụng của 7 hợp chất tiềm năng với hoạt tính ức
chế chọn lọc MAO-B. …………………………………………………………………………………11