Nghiên cứu đột biến gen LDLR ở người tăng cholesterol máu có tính chất  gia đình

Nghiên cứu đột biến gen LDLR ở người tăng cholesterol máu có tính chất gia đình.Bệnh  tăng  cholesterol  máu  có  tính  chất  gia  đình  (familial hypercholesterolemia: FH) là một rối loạn chi phối tự  phát, đặc trƣng bởi sự gia tăng suốt đời của cholesterol trong huyết thanh liên quan đến lipoprotein tỉtrọng thấp (LDL) [1]. Tỉ lệ mắc bệnh FH ƣớc tính trong quần thể trên toàn thếgiới từ 1:500 đến 1:300 [2],[3]. Nguyên nhân chính trong khoảng 85% trƣờng hợp FH là đột biến gen mã hóa  receptor của LDL (LDLr), chịu trách nhiệm làm sạch LDL-cholesterol (LDL-C) khỏi máu tuần hoàn nhờ  quá trình thoái hóa trong tế  bào tổ  chức ngoại biên. Hơn 1000 đột biến khác nhau trên  gen LDLR  ở  nhánh  ngắn  của  nhiễm  sắc  thể  19  (p13.1  –  p13.3)  đã  đƣợc  nhiều nghiên cứu trên thế  giới mô tả  cho đến nay  [4]. Một số  gen khác chịu trách nhiệm cho 20-26% trƣờng hợp FH còn lại là gen  Apolipoprotein B  (ApoB), Proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) là những gen khi bị đột biến làm giảm gắn kết LDL-C với LDLr  hoặc giảm số  lƣợng LDLr  dẫn đến tăng cholesterol trong máu và gây bệnh FH [5]. 

FH là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thƣờng. Những đột biến gâybệnh  FH phần lớn là do di truyền từ  bố, mẹ  hoặc cả  hai cho bệnh nhân. Bệnh nhân FH có đột biến gen  LDLR  biểu hiện mức  cholesterol toàn phần  (TC)  và LDL-C  trong máu  tăng cao rõ rệt dẫn đến lắng đọng cholesterol trong lòng động mạch  ở  lứa tuổi rất sớm, gây xơ vữa động mạch  và  đặc biệt  làm tăng nguy cơ mắc nhồi máu cơ tim  (NMCT). Đặc điểm nhồi máu cơ tim  ở  bệnh nhân FH thƣờng tiến triển tốc độ  nhanh, có thể  gây  đột tử  hoặc các biến cốtim mạch khác trong thập kỷ  thứ  tƣ hoặc thứ  năm của cuộc đời  [6],[7].  Đặc biệt là thể đột biến phức tạp (đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kết hợp…), hầu hết các bệnh nhân trong nhóm này đều mắc CHD nghiêm trọng ở  tuổi 20 và tỉ  lệ  tử  vong hoặc phẫu thuật bắc cầu mạch vành trong những năm thiếu niên là rất cao, hẹp động mạch chủ nặng cũng phổ biến [8],[9].  
Mặc dù có nguy cơ mắc bệnh tim mạch rất cao, nhƣng hầu hết những ngƣời  mắc bệnh FH vẫn không đƣợc chẩn đoán và điều trị  kịp thời hoặc điều trị  không đầy đủ. Bệnh nhân FH đƣợc phát hiện sớm và điều trị  kịp thời có thể ngăn ngừa hoặc giảm mức độ nặng của bệnh lý mạch vành.Chỉ  riêng nồng độ  cholesterol là không đủ  để  xác nhận chẩn đoán  bệnhFH vì nồng độ  cholesterol trong máu thayđổi theo tuổi tác, giới tính và đặc trƣng dân số  [4]. Ngoài ra, phạm vi nồng độ  cholesterol máu trong  bệnh  FH trùng lặp với những ngƣời bị  tăng cholesterol máu đa yếu tố  không di truyền, làm giảm độ  chính xác chẩn đoán. Do đó, tiêu chuẩn chẩn đoán của FH bao gồm các triệu chứng lâm sàng và kết quả xét nghiệm cũng nhƣ tiền sử gia đình về kiểu di truyền trội đối với bệnh tim mạch sớm hoặc tăng cholesterol máu. 
Hiện nay ở  Việt Nam, nhóm bệnh nhân FH chƣa đƣợc thực sự  quan tâm đầy đủ, các xét nghiệm về gen hầu hết chƣa đƣợc thực hiện, nhiều trƣờng hợp trẻ  đến viện vì các biến cố  tim mạch nặng nề. Những công trình nghiên cứu về sinh học phân tử nhằm xác định các dạng  đột biến của gen, đặc biệt là gen LDLR  ở  bệnh nhân FH còn nghèo nàn, do đó việc tƣ vấn điều trị  dự  phòng 
cho bệnh nhân và  các thành viên trong  gia đình nhằm giảm các nguy cơ biến chứng sớm các bệnh lý mạch vành còn chƣa đƣợc thực hiện.Xuất phát  từ  những lý do trên, chúng  tôi  thực  hiện  nghiên  cứu  đề  tài: “Nghiên cứu đột biến gen LDLR ở người tăng cholesterol máu có tính chất gia đình” với 2 mục tiêu chính: 
1.  Xác  định  đột  biến  trên  một  số  vùng  gen  LDLR  ở  bệnh  nhi  tăngcholesterol máu có tính chất gia đình.
2.  Phát hiện đột biến gen LDLR và một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở các thành viên trong phả hệ của bệnh nhi FH mang đột biến gen.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ  ………………………………………………………………………………………  1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN  ………………………………………………………………………  3
1.1. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình  ……………………………..  3
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh  …………………………………………………………..  3
1.1.2. Dịch tễ bệnh FH  ……………………………………………………………………  4
1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh FH……………………………………………….  5
1.1.4. Hậu quả rối loạn chuyển hóa lipid máu  ……………………………………  8
1.1.5. Điều trị……………………………………………………………………………….  10
1.1.6. Cơ chế gây bệnh  ………………………………………………………………….  13
1.2. Gen LDLR và protein LDLr  ……………………………………………………….  16
1.2.1. Vai trò của protein LDLr trong duy trì nồng độ cholesterol máu  .  16
1.2.2. Cấu trúc gen LDLR  ……………………………………………………………..  17
1.2.3. Các loại đột biến gen LDLR  …………………………………………………  19
1.2.4. Ảnh hƣởng đến kiểu hình của đột biến gen LDLR  …………………..  21
1.2.5. Đa hình kiểu gen LDLR và mối liên quan đến bệnh FH  …………..  22
1.2.6. Chƣơng trình quản lý và chiến lƣợc sàng lọc bệnh FH  …………….  26
1.2.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc liên quan ……………………….  27
1.3. Một số kỹ thuật SHPT ứng dụng trong phát hiện đột biến gen  ………..  31
1.3.1. Kỹ thuật khuếch đại gen – polymerase chain reaction (PCR)  …….  32
1.3.2. Giải trình tự gen bằng máy tự động theo nguyên tắc Sanger …….  33
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  ………………  36
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ………………………………………………………………..  36
2.1.1. Nhóm bệnh nhi  ……………………………………………………………………  36
2.1.2. Nhóm các thành viên trong gia đình bệnh nhi  …………………………  36 
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu  …………………………………………………………….  37
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu  ……………………………………………………………..  37
2.2.2. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu  ………………………………………..  37
2.2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu  ……………………………………………………….  38
2.2.4. Các kỹ thuật nghiên cứu  ……………………………………………………….  39
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………..  49
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu:  ………………………………………………………….  50
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu…………………………………………………………..  50
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU  ……………………………………………….  52
3.1. Một số đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu  …………………………  52
3.1.1. Đặc điểm về tuổi  …………………………………………………………………  52
3.1.2. Đặc điểm về giới  …………………………………………………………………  53
3.1.3. Đặc điểm về triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng  …………………  53
3.2. Xác định đột biến trên exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR  ……………………  57
3.2.1. Tách DNA từ máu toàn phần  ………………………………………………..  57
3.2.2. Phản ứng khuếch đại exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR  ……………….  58
3.2.3. Kết quả giải trình tự exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR  ………………..  60
3.3. Kết quả phân tích phả hệ  …………………………………………………………….  72
3.3.1. Phả hệ gia đình bệnh nhi MS02 và MS08……………………………….  72
3.3.2. Phả hệ gia đình bệnh nhi MS03  …………………………………………….  78
3.3.3. Phả hệ gia đình bệnh nhi MS15  …………………………………………….  81
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN  ……………………………………………………………………  86
4.1. Bàn luận về các đột biến và SNP tìm đƣợc trên bệnh nhi FH  ………….  88
4.2. Phả hệ gia đình bệnh nhi có đột biến gen LDLR  ………………………….  112
KẾT LUẬN  ………………………………………………………………………………………  126
KIẾN NGHỊ  ……………………………………………………………………………………..  128
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.   Tiêu chuẩn chẩn đoán DLCN cho bệnh FH ……………………………  6
Bảng 1.2.   Tiêu chuẩn chẩn đoán MEDPED cho bệnh FH  ……………………….  8
Bảng 2.1.   Trình tự mồi khuếch đại exon 3, 4, 9, 13, 14 của gen LDLR  …..  47
Bảng 2.2.   Thành phần phản ứng PCR khuếch đại exon 3, 4, 9, 13, 14  ……  47
Bảng 2.3.   Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại exon 3  ……………  48
Bảng 2.4.   Thành phần phản ứng giải trình tự gen  …………………………………  48
Bảng 2.5.   Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự gen  ………………………  49
Bảng 3.1.   Đặc điểm về tuổi của nhóm bệnh nhi trong nghiên cứu  ………….  52
Bảng 3.2.   Đặc điểm về giới của nhóm bệnh nhi trong nghiên cứu  ………….  53
Bảng 3.3.   Đặc điểm u vàng và chỉ số lipid máu của nhóm bệnh nhi  ……….  54
Bảng 3.4.   Đặc điểm chỉ số lipid máu của nhóm bệnh nhi phát hiện FH trong 
quá trình nghiên cứu  ………………………………………………………….  56
Bảng 3.5.   So sánh chỉ số lipid máu của 2 nhóm bệnh nhi  ……………………..  56
Bảng 3.6.   Kết quả  đo độ  tinh sạch và nồng độ  DNA của 26 bệnh nhi FH 
ban đầu  …………………………………………………………………………….  57
Bảng 3.7.   Các loại đột biến và SNP đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu  ……..  67
Bảng 3.8.   Đặc điểm các chỉ số lipid máu  …………………………………………….  70
Bảng 3.9.   Đặc điểm về  các chỉ  số  lipid máu giữa nhóm đột biến dạng nặng 
với nhóm đột biến dị hợp tử………………………………………………..  71
Bảng 3.10.   Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các thành viên trong 
phả hệ gia đình bệnh nhi MS02  …………………………………………..  76
Bảng 3.11.   So  sánh  chỉ  số  lipid  máu  giữa  các  thành  viên  mang  2  đột  biến 
khác nhau  …………………………………………………………………………  77
Bảng 3.12.    Đặc  điểm  các  chỉ  số  lipid  máu  giữa  nhóm  đột  biến  dị  hợp  tử  và 
không đột biến  ……………………………………………………………………  78 
Bảng 3.13.   Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các thành viên trong 
phả hệ gia đình bệnh nhi MS03  …………………………………………..  80
Bảng 3.14.   Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các thành viên trong 
phả hệ gia đình bệnh nhi MS15  …………………………………………..  84
Bảng 3.15.   Đặc  điểm  về  chỉ  số  lipid  máu  ở  nhóm  đột  biến  dị  hợp  tử  và 
không đột biến của phả hệ MS15  ………………………………………..  85
Bảng 4.1.   Chỉ số lipid máu ở một số nghiên cứu  ………………………………….  90
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.   Các hình thái lâm sàng nổi bật của bệnh FH   …………………………….  5
Hình 1.2.   Chuyển hóa lipoprotein nội và ngoại sinh   ………………………………  13
Hình 1.3.   Quá trình chuyển hóa LDL   …………………………………………………..  15
Hình 1.4.   Chức năng sinh lý của protein LDLr   ……………………………………..  16
Hình 1.5.   Cấu trúc của gen và protein LDLr   …………………………………………  19
Hình 1.6.   Mô phỏng hiện tƣợng đa hình đơn nucleotide  …………………………  23
Hình 1.7.   Mô hình sàng lọc phân tầng bệnh FH …………………………………….  26
Hình 1.8.   Tỉ lệ các loại đột biến ở các exon của gen LDLR   ……………………  29
Hình 2.1.   Hình ảnh trình tự exon 13 và các vùng intron liền kề thông qua 
phần mềm CLC Main Workbench 8.1.2 phiên bản giới hạn.  …….  44
Hình 2.2.   Hình ảnh chọn mồi đặc hiệu dựa trên phần mềm Primer-BLAST  …  45
Hình 2.3.   Các cặp mồi gợi ý với một số đặc tính cụ thể sau khi sử dụng phần 
mềm Primer-BLAST của NCBI  …………………………………………….  46
Hình 2.4.   Sơ đồ thiết kế nghiên cứu  ……………………………………………………..  51
Hình 3.1:   Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 3 với mồi LDLR  ……..  58
Hình 3.2:   Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 4 với mồi LDLR  ……..  59
Hình 3.3:   Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 9 với mồi LDLR  ……..  59
Hình 3.4:   Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 13, 14 với m ồi LDLR  …  60
Hình 3.5.   Hình ảnh đột biến c.664T>C trên exon 4 gen LDLR  ………………..  61
Hình 3.6.   Hình ảnh đột biến đồng hợp tử c.664T>C trên exon 4 gen LDLR  61
Hình 3.7.   Hình ảnh đột biến c.1285G>A trên exon 9 gen LDLR  ……………..  62
Hình 3.8.   Hình ảnh đột biến c.1335C>T trên exon 9 gen LDLR  ………………  63
Hình 3.9.   Hình ảnh đột biến c.1978C>T  ……………………………………………….  63
Hình 3.10. Hình ảnh SNP rs1003723 dị hợp tử và đồng hợp tử.  ………………..  64
Hình 3.11. Hình ảnh SNP rs5925 dị hợp tử và đồng hợp tử  ………………………  65
Hình 3.12. Hình ảnh u vàng ở da bệnh nhi MS02 ……………………………………  72 
Hình 3.13. Đột biến exon 4, 9 ở phả hệ gia đình bệnh nhi MS02  ………………  74
Hình 3.14. Hình ảnh u vàng ở da bệnh nhi MS03 ……………………………………  79
Hình 3.15. Đột biến trên exon 4 phả hệ gia đình bệnh nhi MS03  ………………  79
Hình 3.16. Hình ảnh u vàng ở da bệnh nhi MS15 ……………………………………  81
Hình 3.17. KQ đột biến Exon 4 của phả hệ gia đình bệnh nhi MS15  …………  82
Hình 4.1.   Dự đoán khả năng gây bệnh đột biến c.664T>C bằng phần mềm 
Polyphen 2  ………………………………………………………………………….  96
Hình 4.2.   Dự đoán khả năng gây bệnh đột biến c.664T>C bằng phần mềm 
MutationTaster…………………………………………………………………….  97
Hình 4.3.   Dự đoán khả năng gây bệnh đột biến c.664T>C bằng phần mềm 
SIFT  …………………………………………………………………………………..  98
Hình 4.4.   Dự đoán khả năng gây bệnh đột biến c.1335C>T bằng phần mềm 
MutationTaster…………………………………………………………………..  100
Hình 4.5.   Vị trí đột biến c.1978C>T tạo mã stop codon và vùng mã hóa cho 
protein LDLr tƣơng ứng.  …………………………………………………….  101
Hình 4.6.   Hiệu quả của chất ức chế NMD trên hiệu quả dịch mã của LDLR 
mRNA đƣợc xác định vởi Realtime-PCR và Northen blots đƣợc 
thực nghiệm trên tế bào bình thƣờng và tế bào có đột biến vô nghĩa 
dị hợp tử p.S78*  ………………………………………………………………..  1