Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát

Luận án Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát.Ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở các nước phát triển và là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở các nước đang phát triển [117]. Gánh nặng về ung thư tiếp tục gia tăng trên diện rộng vì sự già hóa và phát triển dân số, cùng với sự gia tăng các yếu tố nguy cơ gây ung thư. Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2008, trên thế giới có khoảng 12,7 triệu trường hợp ung thư mắc mới và 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư. Trong đó có 56% trường hợp do ung thư mắc mới và 64% trường hợp do ung thư xảy ra ở các nước phát triển [28]. Dự đoán vào năm 2020, tỷ lệ mắc ung thư sẽ tăng 50%. Ung thư dạ dày (UTDD), ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là hai trong số năm bệnh lý ung thư hàng đầu [28], [59], [60]. Cho tới nay tuy chưa có số liệu điều tra chính xác về dịch tễ học UTDD trong phạm vi cả nước nhưng theo các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UTDD khá cao trong cộng đồng. Theo ghi nhận ung thư ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTDD năm 2000 ở nam giới là 23,7/100.000 người, đứng hàng thứ 2 sau ung thư phổi, ở nữ giới là 10,8/100.000 người, đứng hàng thứ 3 sau ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Việt Nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTGNP cao, hiện chưa có số liệu thống kê cụ thể về tình hình ung thư gan trên phạm vi toàn quốc, nhưng theo một số báo cáo tại các cơ sở điều trị lớn trong nước thì ung thư gan là loại hình ung thư đáng báo động. Điều tra của Phạm Hoàng Anh tại 22 cơ sở y tế của Hà Nội năm 2002 cho thấy UTGNP đứng hàng thứ 3 ở nam giới và hàng thứ 6 ở nữ giới [1].

Chẩn đoán UTDD và UTGNP dựa vào chẩn đoán hình ảnh (siêu âm, nội soi, chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ hạt nhân, chụp động mạch gan, chẩn đoán bằng đồng vị phóng xạ), chẩn đoán tế bào học và mô bệnh học, định lượng nồng độ Alpha Fetoprotein (AFP). Tuy nhiên, chẩn đoán UTDD và

UTGNP bằng các phương pháp kể trên chỉ chẩn đoán được khi khối u đã hình thành, phát triển rõ và thường là giai đoạn muộn của bệnh. Có thể nói chúng ta đang phải đối mặt với cuộc chiến đầy cam go và thách thức nhằm chống lại những mất mát về người và sự tốn kém về kinh tế trong việc điều trị căn bệnh ung thư. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh học của ung thư để từ đó có thể tìm ra phương pháp chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả là vấn đề thách thức và được quan tâm đặc biệt của các nhà Y sinh học hiện đại.

Activation Induced cytidine Deaminase (AID) là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) và tái tổ hợp (class switch recombination) gen kháng thể [78], [80]. Trong điều kiện sinh lý bình thường, sự biểu hiện AID giới hạn tại tế bào lympho B hoạt hóa sinh kháng thể và được kiểm soát chặt chẽ bởi các yếu tố điều hòa [54], [71]. Khi gen AID bị đột biến thì gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch, tăng IgM2 bẩm sinh ở người. Mặt khác, ở tế bào không có thẩm quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến để khởi đầu cho quá trình ung thư hóa tế bào lành [65], [78], [90], [95]. Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến gen như vậy nên AID được coi như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng. Dưới tác động của các yếu tố hoạt hoá, AID sẽ tác động trực tiếp lên các gen áp chế ung thư, tích lũy đột biến, từng bước làm bất hoạt và mất chức năng của các gen áp chế ung thư này [52] [99].

Gen p53 là gen áp chế ung thư quan trọng nhất, có vai trò ức chế chu trình tế bào, gây apoptosis và tương tác với một số gen để kiểm soát sự tăng sinh, biệt hoá của tế bào [100]. Các nghiên cứu cho thấy, p53 có vai trò quan trọng trong một số bệnh lý ung thư của người. Đột biến hoặc mất gen p53 được phát hiện trên 50% trường hợp ung thư và trên 60% trường hợp UTDD và UTGNP [43], [63].

Kể từ khi gen AID được phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của Gs Tasuku Honjo tại Trường Đại học tổng hợp Kyoto, Nhật Bản vào năm 1999 đến nay, đã có nhiều công trình khoa học công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng nhất trên thế giới về vai trò của AID, trong đó có mối liên quan giữa AID và p53 trong sự phát sinh, phát triển UTDD và UTGNP. Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về gen AID trong UTDD và UTGNP. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát” được thực hiện với ba mục tiêu:

1. Đánh giá mức độ phiên mã gen AID ở mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát so sánh với mô lành đối chứng.

2.  Xác định tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát.

3. Xác định mối tương quan giữa mức độ phiên mã gen AID với đột biến gen p53 trên mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ  1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. UNG THƯ DẠ DÀY  4

1.1.1. Dịch tễ học  4

1.1.2. Yếu tố nguy cơ  5

1.1.3. Giải phẫu bệnh và phân loại 6

1.1.4. Chẩn đoán ung thư dạ dày 7

1.2. UNG THƯ GAN  9

1.2.1. Dịch tễ học  9

1.2.2. Yếu tố nguy cơ  11

1.2.3. Hình ảnh giải phẫu bệnh  12

1.2.4. Chẩn đoán ung thư gan  13

1.3. CÁC BIẾN ĐỔI PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ GAN VÀ UNG THƯ

DẠ DÀY 16

1.3.1. Gen gây ung thư (oncogene)  16

1.3.2. Gen áp chế ung thư 16

1.3.3. MicroRNA 17

1.4. VAI TRÒ GEN p53 TRONG UNG THƯ  17

1.4.1. Cấu trúc của gen p53  17

1.4.2. Chức năng p53  18

1.4.3. Gen p53 đột biến  21

1.5. VAI TRÒ GEN AID TRONG UNG THƯ  24

1.5.1. Cấu trúc của gen AID 24

1.5.2. Vai trò sinh học của gen AID 24

1.5.3. Cơ chế hoạt động của gen AID trong quá trình tái tổ hợp gen

kháng thể  25

1.5.4. Đột biến gen AID gây hội chứng tăng IgM bẩm sinh trên người  27

1.5.5. Vai trò gen AID trong ung thư 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1. Đối tượng nghiên cứu 34

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hoá chất nghiên cứu  34

2.3. Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1. Lấy mẫu 38

2.3.2. Quy trình tách chiết DNA  38

2.3.3. Quy trình tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 41

2.3.4. Quy trình xác định đột biến gen p53  44

2.3.5. Đánh giá mức độ phiên mã gen AID bằng kỹ thuật Real-time PCR 49

2.3.6. Xác định HBV DNA bằng kỹ thuật Real time PCR  54

2.4. Xử lý số liệu  55

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM NGHIÊN CỨU 56

3.1.1. Nhóm bệnh nhân gan  56

3.1.2. Nhóm bệnh nhân dạ dày 57

3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA, RNA VÀ TỔNG HỢP cDNA 58

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA  58

3.2.2. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 61

3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN P53  65

3.3.1. Nhóm mô gan  68

3.3.2. Nhóm mô dạ dày   69

3.4. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID 69

3.4.1. Nhóm mô gan  71

3.4.2. Nhóm mô dạ dày  77

3.5. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID VÀ ĐỘT

BIẾN GEN P53  85

3.5.1. Nhóm mô gan  85

3.5.2. Nhóm mô dạ dày  86

Chương 4: BÀN LUẬN 87

4.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM NGHIÊN CỨU 90

4.1.1. Nhóm bệnh nhân gan  90

4.1.2. Nhóm bệnh nhân dạ dày 91

4.2. KẾT QUẢ VỀ TÁCH CHIẾT DNA, RNA VÀ TỔNG HỢP cDNA  91

4.2.1. Kết quả tách chiết DNA  91

4.2.2. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 92

4.3. TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 93

4.3.1. Nhóm mô gan  94

4.3.2. Nhóm mô dạ dày  95

4.4. MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID TRÊN MÔ GAN VÀ MÔ DẠ DÀY 96

4.4.1. Nhóm mô gan  98

4.4.2. Nhóm mô dạ dày  100

4.5. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID VÀ ĐỘT

BIẾN GEN P53  101

4.5.1. Nhóm mô gan  101

4.5.2. Nhóm mô dạ dày  102

KẾT LUẬN  105

KIẾN NGHỊ 106

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Lê Thị Thúy, Trần Vân Khánh, Lê Hữu Song, Tạ Thành Văn (2011), “Khảo sát tỷ lệ đột biến gen p53 trên bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát”, Y học Việt Nam, 2(1), tr. 64-68.
2. Lê Thị Thúy, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011), “Sao chép gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) ở mô ung thư dạ dày”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 72(1), tr. 16-21.
3. Lê Thị Thúy, Trần Huy Thịnh, Ôn Quang Phóng, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2012), “Mối liên quan giữa mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan”, Tạp chí Nghiên cứu Y học (đang gửi đăng).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trường, Trịnh Thị Hoa, Chu Hoàng Hạnh, Bùi Hải Đường (2002). “Tình hình ung thư trên người Hà Nội giai đoạn 1996-1999”, Tạp chí Y học thực hành, số 10/2002, chuyên đề ung thư học, tr 431-4.
2. Nguyễn Đại Bình (1997). “Ung thư gan nguyên phát”, Bài giảng ung thư học, Nhà Xuất Bản Y học, tr 205-209.
3. Bộ môn Giải phẫu bệnh, trường đại học Y Hà Nội (2000). “Giải phẫu bệnh học”, Nhà xuất bản Y học.
4. Hoàng Đình Cầu (2003). ‘ Môi trường và sức khỏe ở Việt Nam (30 năm sau chiến dịch Ranch Hand ”, NXB Nghệ An, tr 18-20.
5. Nguyễn Thanh Đạm, Dương Thị Cương, Hà Văn Mạo và cs (1991). “Định lượng Alpha-Fetoprotein ở bệnh nhân ung thư gan bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA)”, Y học Việt Nam, 158, tr13-16.
6. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998). ‘ ‘Sinh học phân tử”, Nhà xuất bản Giáo dục Hà Nội.
7. Nguyễn Lam Hòa, Lê Trung Dũng, Trần Quang Hưng (2006). “Chẩn đoán và điều trị phẫu thuật ung thư dạ dày tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng (từ 01/2004-12/2005). Yhọc thực hành, tr 541:441-449.
8. Trần Quỳnh Hoa, Nguyễn Thúy Vinh, Nguyễn Thị hồng Hạnh (2002). ‘Vi khuẩn Helicobacter pylori là thủ phạm chủ yếu của hầu hết các bệnh dạ dày-tá tràng”. Thuốc và sức khỏe, 131(1297).
9. Trần văn Hợp (1998). “Bệnh của dạ dày”, Giải phẫu bệnh học, NXB Y học, tr 318-346.
10. Tạ Long (2003). ‘Bệnh lý dạ dày tá tràng và Helicobacter Pylori”, Nhà xuất bản y học.
11. Hà Văn Mạo, Hoàng kỳ, Phạm Hoàng Phiệt (2006). “UTG nguyên phát. Chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư”, Nhà xuất bản y học, tr 13-40.
12. Hà Văn Mạo, Hoàng Kỳ, Phạm Hoàng Phiệt và tập thể các tác giả (2006). “ UTG nguyên phát”, Nhà xuất bản Y học, tr 13-404.
13. Đoàn Hữu Nghị (2007). “UTG nguyên phát, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư”, Nhà xuất bản Y học, tr 238.
14. Trịnh Văn Quang (2002). “Những khối u gan”, Bách khoa thư bệnh học.
15. Trịnh Văn Quang (2002). “Ung thư dạ dày” Bách khoa thư ung thư học, Nhà xuất bản Y học, tr 160-168.
16. Hoàng Văn Sơn, Đỗ Đức Vân, Đào Kim Chi, Hoàng Hạnh Phúc (2002), ‘ ‘Các dấu ấn ung thư trong chẩn đoán ung thư đường tiêu hóa”, Tạp chí thông tin Y dược, tr 88-91.
17. Trịnh Hồng Sơn, Phạm Văn Bình, Cao Độc Lập, Đỗ Đức Vân (1999).
“Chẩn đoán và điều trị phẫu thuật ung thư dạ dày tái phát”, Y học thực hành 5, tr 8-10.
18. Hoàng Trọng Thản (2006). “Bệnh tiêu hóa gan mật”, Nhà xuất bản Y học, tr 332.
19. Nguyễn Khánh Trạch, Phạm Thị Thu Hồ (1997). “Ung thư gan nguyên phát”, Bài giảng bệnh học nội khoa tập II, tr 167-174.
20. Nguyễn Sào Trung và cs (1998). ‘ ‘UTGNP và viêm gan virut B: Khảo sát bệnh học và hóa mô miễn dịch”, Y học TP Hồ Chí Minh, Phụ bản chuyên đề ung bướu học, tập 2-số 3:37-41.
21. Trần Thiện Trung (2008). “Bệnh dạ dày-tá tràng và nhiễm Helicobacter pylori”. Nhà xuất bản Y học.
22. Trường đại học y Hà Nội, Bộ môn giải phẫu bệnh (2007). “Giải phẫu bệnh học”, Nhà xuất bản y học, tr 318-346.
23. Phạm Hùng Vân (2009). “PCR và Real-time PCR. Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp”. Nhà xuất bản y học.
24. Tạ Thành Văn (2004). “Activation-Induced Cytidine Deaminase (AID)- Phát minh mới về cơ chế phân tử của quá trình tổng hợp kháng thể”, Tạp chí nghiên cứu Y học 28 (2), tr 116-119.
25. Tạ Thành Văn (2006). “Nghiên cứu thể đột biến bất hoạt của activation induced cytidine deaminase (AID) người”, Tạp chí Y học Việt Nam 5, tr 48-53.
26. Tạ Thành Văn (2010). ‘ ‘Con đường tín hiệu tế bào và dấu ấn sinh học trong chan đoán”, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. tr72-74.