ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TÌM GEN TDF TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NHÂN CHƯA RÕ GIỚI TÍNH.

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TÌM GEN TDF TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NHÂN CHƯA RÕ GIỚI TÍNH.Sự bất thường trong biột hoá giới tính đã được biết từ rất lâu. Người ta thấy trong một viện bảo tàng của Anh ở London đã triển lãm và dự đoán hậu quà gây ra cho xã hội và gia đình của 62 trường hợp biến đổi giới này . Ngày nay, sự mập mở giới tính không còn được xem như một thảm hoạ của gia đình và xã hội nữa nhưng nó lại thường xuyên gây cho bản thân bệnh nhân những sự đau đớn về tâm lý và sự lo láng của bố mẹ và gia đình nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm.

Sự ấn định giới tính bình thường là do 2 nhiễm sắc thể X và Y quyết định, trong đó nhiễm sắc thể Y quyết định sự hình thành giới tính nam .

Còn quá trình biột hoá giới tính chính là kết quả của tác động qua lại giữa kiểu gen và hormon , cuối cùng tạo nên kiểu hình là nam hay nữ. Chi tiết hơn về gen học thì vùng trên NST Y quyết định biệt hoá tinh hoàn là vùng SRY (Sex Determining Region Y) và nằm trên vùng đó có một gen mã cho TDF (Testis Determining Factor = yếu tố quyết định phát triển tinh hoàn) có vai trò quyết định biệt hoá giới tính nam [121]. Ngoài ra, ở nhánh dài NST Y có một vùng hoàn toàn đặc hiệu cho NST này vì nó không giống với cấu trúc nào trong 22 đôi NST còn lại về trình tự và cách lặp lại: người ta gọi đó là vùng heterochromatin, gen DYZ 1 và DYZ 2 nằm ở đây . Gen DYZ 1 có khoảng 3000 bản lặp lại của 5 nuclcotid TTCCA, còn DYZ 2 có 2000 bản lặp lại.Nằm sát nó về phía tâm động còn có gen AZFc ( Azoospermia factor ) là gcn mà khi nó bị đột biến sẽ gây ra tình trạng không có tinh trùng ở nam giới [99,101]. Những rối loạn có thể xảy ra ở mỗi giai đoạn khác nhau của quá trình ấn định hay biệt hoá giới tính, tạo ncn hình ảnh lâm sàng của rối loạn giới tính rất đa dạng.

Dựa vào mô học của cơ quan sinh dục người ta phân loại thành các thể sau: lưỡng giới giả nữ ( giả ái nam ái nữ nừ), lưỡng giới giả nam ( giả ái nam ái nữ nam) và lưỡng giới thật ( ái nam ái nữ thật). 

•Ở Việt nam ,bệnh chưa rõ giới tính cũng thường gặp trong lâm sàng. Bệnh nhân đến bộnh viện với chẩn đoán của tuyến dưới là ái nam ái nữ hay chưa rõ giới tính. Theo số liệu của khoa nội tiết di truyền viện hảo vộ sức khoẻ trẻ em 1981 – 1990 bệnh nhân đến khám vì ái nam ái nữ chiếm 1,64% tổng số bệnh nhân nội tiết của khoa.Nguyên thu Nhạn và cs 1994 nghiên cứu về HcSDTT có tới 60% trỏ gái bị nam hoá trong lổng số bệnh nhân nghiên cứu [14 15].

Nguyễn thị Phượng 1997 nghiên cứu về đặc điểm di truyền của HcSDTĨ thấy tre gái bị nam hoá là 51,68% trong tổng số bệnh nhân nghiên cứu [18] . Đổng thời, tác giả còn nghiên cứu về tình hình bệnh di truyền trong 6 năm tại viện nhi từ 1991 – 1997 thấy hội chứng sinh dục thượng thận chiếm 11, 4% tổng số bệnh nhân di truyền của khoa [19]. Ngoài ra, Võ thị kim Huệ 1997 nghicn cứu về tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu 21 Hydroxylase thế nam hoá đơn thuần ở trẻ cm , trong số bệnh nhân nghiên cứu gặp 83% ở trẻ gái [7]. Song các công trình trên đều dựa vào lâm sàng chưa có điều kiện đi sâu vào gen học ncn có hạn chế nhất định trong việc xác định giới lính cho bệnh nhản.

Chấn đoán bệnh chưa rõ giới tính (ái nam ái nữ=hermaphroditism) là một khó khãn cho các nhà lâm sàng nếu thiếu các phương tiện xét nghiệm. Chẩn đoán xác định phải theo dõi qua một thời gian, hay tiến triển theo điều trị thừ … do đó ảnh hường đến việc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Mặt khác các kỹ thuật để phục vụ cho chẩn đoán chi chủ yếu dựa trên karyotyp, vật thể Barr … hay định lượng hormon tcstosteron ở dạng tiền hoạt động .

Trong những năm gần đây, những tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực nghiên cứu di truyền phân tử đã giúp cho y học tìm ra nguycn nhân của nhiều bệnh di truyền mà trước đây không biết được. Mội trong những thành tựu đó là phát minh ra kỹ thuật PCR 1985 bởi Kary Mullis [1], người ta ứng dụng nó một cách nhanh chóng trong việc xác định giới tính như: McElreavey K, Fellous và cs 1992 tìm gcn TDF, gen trên nhánh ngán NST Y đổ nghiên cứu cho nhóm bệnh nhân mập mờ giới tính 198]. Kaoru Suzumorie và cs 1992 tìm gen Amclogcnin và gen DYZ , gen trên nhánh dài NST Y để xác định giới tính nam cho thai nhi [125].

Ớ Việt nam, cho đến nay đa số các tác giả dã xử dụng các kỹ thuật như tìm vật thể Barr và karyotyp để xác định giới tính . Kỹ thuật xác định giới tính bằng vật thể Barr nhanh chóng nhưng độ chính xác thấp, xác định bộ NST chính xác hưn, nhưng mất nhiều thời gian, phụ thuộc nhiều vào chủ quan người đọc và chí dừng lại ở mức NST.Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định tình trạng các gen trên nhiễm sắc thổ giới có vai trò quan trọng trong ấn định và hình thành giới tính (ví dụ như gen TDF trên NST Y ) thì chưa có một công trình nào nghiên cứu.

Vì vậy mục tiêu của đc tài này là:

/. Sử dụng kỹ thuật PCR tìm gen TDF xác định giới tính nam cho các bệnh nhân chưa rô giới tính 

2. Đối chiếu kết quả của PCR với kết qủa của di truyền tế bào và với lâm sàng để xác định giới tính chính xác cho bệnh nhân chưa rổ giới tính.

3. Dựa trên các kết quả PCR tìm gen TDF và gen DYZ bước đáu phát hiện một số nguyên nhân chưa rõ giới tính.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1. Sự hình thành giới tính 4

ỉ.LI. Sự hình thành giới tính gen học 5

1.1.2. Sự hình thành giới tính sinh dục 9

1.1.3. Sự hình thành kieu hình của giới và các hortnon sinh dục 13

1.2. Những rỏi loạn trong quá trình hình thành giới tính 18

1.2.1. Khái niệm 18

1.2.2. Phân loại, biểu hiện làm sàng và cơ chế bệnh sinh của

một số rối loạn giới 18

1.3. Các phưưng pháp xét nghiệm được dùng đế chẩn đoán xác

định giới tính trong trường hợp mơ hồ giới tính 32

ỉ.3.1. Vật thẻBarr 32

1.3.2. Vật thể Y 33

1.3.3. Nuôi cấy xếp bộ nhiễm sắc thể 33

13.4. Kỹ thuật sinh học phán tử và ứng dụng đẻ xác định gen TDF 34

1.3.5. Một số xét nghiệm khác góp phẩn chẩn đoán 38

1.4. Tình hình nghiên cứu giới tính và mơ hồ giới tính 39

1.4,1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước 39

ỉ.4.2. Tỉnh hình nghiên cứu trong nước 40 

CHƯƠNG 2: Đối TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đòi tượng nghiên cứu

2.2. Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật 43

2.2.2. ứng dụng trên bệnh nhàn 47

2.2.3. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tim công thức nhiễm sắc thể 49

2.2.4. Đối chiêu kết quả PCR với kết quả karyotyp 49

2.2.5. Các kỹ thuật sinh hoá để định lượng 50

2.2.6. Chụp X quang 5 ỉ

2.2.7. Siêu àm 51

2.2.8. Phương pháp nghiên cứu phôi hợp lâm sàng với PCR và

karyotyp 51

2.3. Xử lý sô liệu 54

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 55

3.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật 55

3.2. ứng dụng kỹ thuật PCR cho nhóm bệnh nhàn nghiên cứu 58

3.2.1. Đặc điếm của nhóm nghiên cứu 58

3.2.2. Kiểm tra chất lượng ADN chiết tách ở nhóm bệnh nhân

nghiên cứu 59

3.2.3. Kết quả PCR khuếch đại gen TDF và AMELY ở 40 bệnh

nhân chưa rò giới 62

3.2.4. Các kiểu karyotyp của nhóm bệnh nhân nghiên cứu 63 

3.2.5. Đôi chiếu giữa kết quả PCR xác định gen TDF và

AMELY với công thức nhiễm sắc thể trên 40 bệnh nhàn 64

3.2.6. Kết quả PCR xác định nhiễm sắc thểY 65

3.3. Phối hợp triệu chứng lâm sàng với các kết quả xét nghiệm của 70

bệnh nhân trong chẩn đoán thê bệnh

3.3.1. Giả ái nam ái nừ nam 71

3.2.2. Gid ái nam ái nữ nừ 74

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 76

4.1. Quá trình chuẩn kỹ thuật 76

4.1.1. PCR xác định gen TDF và ÁMELY ở nhóm chíaig 76

4.1.2. Kiểm tra chất lượng ADN chiết tách 78

4.2. Tuổi được chan đoán của bệnh nhàn 81

4.3. Kết quá xác định giới tính của bệnh nhân bàng kỷ thuật PCR 81

4.4. Đối chiếu kết quả PCR và nuôi cấy nhiễm sác thể trên 40 bệnh 82

nhân

4.4.1. Đối chiểu kết quả PCR tìm TDF và AMELY với nuôi cấy 82 nhiễm sắc thế

4.4.2. Kết quả PCR xác định nhiễm sắc thẻ Y 83

4.5. Phôi hợp triệu chứng lâm sàng và các kết quả xét nghiệm của 85

bệnh nhân trong chẩn đoán thê bệnh

KẾT LUẬN 98

NHỮNG ĐÓNCỈ GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 100

KIẾN NGHỊ 101