Nghiên cứu đột biến gen G6PD ở một số dân tộc miền Bắc Việt Nam

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu đột biến gen G6PD ở một số dân tộc miền Bắc Việt Nam.Glucose 6 phosphatase dehydrogenase (G6PD, EC 1.1.1.49) là enzyme oxy hoá khử nằm trên bề mặt hồng cầu (HC), có vai trò then chốt trong chu trình pentose phosphat (PP). G6PD oxy hoá Glucose 6 – Phosphate (G6P) thành 6 Phospho Gluconolactone (6-PG) và khử Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADP) thành NADP dạng xúc tác (NADPH+), là một co-enzyme quan trọng bảo vệ các tế bào hồng cầu (HC) khỏi các gốc oxy 1-4. Thiếu hụt G6PD là bệnh lý enzyme phổ biến nhất ở người và có gánh nặng dịch tễ học lớn nhất trên toàn thế giới 5. Phần lớn bệnh nhân với các biến thể G6PD không có triệu chứng lâm sàng trong suốt cuộc đời của họ ngoại trừ, do vậy, người thiếu G6PD không biết mình mắc bệnh, trừ khi gặp các tác nhân oxy hoá như thức ăn, thuốc, nhiễm trùng, hoá chất,…Biến chứng nặng nề nhất ở người thiếu G6PD là gây tan máu cấp tính có thể dẫn đến tử vong.

Đặc biệt ở trẻ sơ sinh có thể liên quan đến tăng nguy cơ mắc bệnh vàng da sơ sinh và bệnh não do tăng bilirubin. Việc quản lý hiệu quả nhất sự thiếu hụt G6PD là ngăn chặn tan máu bằng cách tránh các tác nhân oxy hóa nên đòi hỏi bệnh nhân cần nhận thức được về tình trạng thiếu hụt enzyme này 1-3. Glucose 6 phosphatase dehydrogenase được mã hóa bởi gen G6PD nằm trên nhánh dài, vùng 2, băng 8 của nhiễm sắc thể (NST) giới tính X (Xq28). Vì vậy, sự di truyền của sự thiếu G6PD cho thấy một kiểu liên kết NST X điển hình với nam giới bị bệnh sẽ luôn là dị hợp tử, còn lại nữ giới có thể dị hợp tử hoặc hiếm hơn là đồng hợp tử. Nữ dị hợp tử là sự ghép gen do bất hoạt NST X nên hoạt động enzyme có thể dao động từ bình thường hoặc thiếu, khiến cho việc chẩn đoán sẽ gặp nhiều khó khăn6. Các đột biến phân bố trên khắp gen G6PD có thể dẫn đến thay thế axit amin và sau đó là các biến thể protein với các mức độ hoạt động của enzyme 2,7. Khoảng hơn 217 biến thể di truyền trong gen G6PD đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu, phần lớn trong số đó là các đột biến sai lệch với một sự thay thế bazơ duy nhất và được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại thành năm loại dựa trên hoạt tính của enzyme còn lại và các biểu hiện lâm sàng 8. Tỷ lệ mắc bệnh và phân bố và các loại biến thể G6PD có liên quan đến các vị trí địa lý cụ thể và các nhóm dân tộc2 khác nhau, gặp nhiều ở lưu hành bệnh sốt rét (SR) như lưu vực Địa Trung Hải, Trung Đông, Châu Phi và Châu Á. Tại Châu Á, tỷ lệ mắc và phân bố gặp nhiều quốc gia, đặc biệt các nước nằm trong khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông mở rộng (GMS) 9-11, trong đó có Việt Nam khoảng 2-31% cũng thay đổi tùy theo dân tộc và khu vực 11-14.
Có ít nhất 8 đột biến phổ biến khác nhau đã được xác định trong dân số Việt Nam rất khác nhau giữa các khu vực hoặc dân tộc, các đột biến này đa phần là thuộc các exon trọng điểm trên ở các nước châu Á 15-18. Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng tỷ lệ thiếu enzyme G6PD ở Việt Nam rất khác nhau giữa các khu vực hoặc dân tộc, phổ đột biến của bệnh trong dân số Việt Nam đã được khảo sát nhưng những nghiên cứu này chỉ bao gồm một số lượng nhỏ người và bị giới hạn về mặt địa lý. Thông tin liên quan đến đặc điểm phân tử của G6PD ở Việt Nam cho đến nay vẫn còn rời rạc. Rất ít khảo sát dịch tễ học phân tử trên toàn quốc về tình trạng thiếu enzyme G6PD được báo cáo Và cho đến nay, không có nghiên cứu nào về mối tương quan giữa các đột biến G6PD cụ thể và kiểu hình hoạt động G6PD được báo cáo. Nhằm củng cố thêm chẩn đoán chính xác bệnh đặc biệt là các trường hợp nữ dị hợp tử và đóng góp vào cơ sở dữ liệu về nghiên cứu bệnh thiếu enzyme G6PD tại Việt Nam trên nhóm dân tộc khác nhau, giúp cho chẩn đoán người lành mang bệnh, tư vấn di truyền trước sinh nhằm giảm tỉ lệ mắc bệnh, giảm hậu quả cho gia đình bệnh nhân và xã hội, nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe trong cộng đồng, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đột biến gen G6PD ở một số dân tộc miền Bắc Việt Nam” với mục tiêu:
1. Xác định đột biến của gen G6PD ở bệnh nhân thiếu hụt enzyme G6PD thuộc một số dân tộc miền Bắc Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
2. Phân tích đột biến gen G6PD ở một số gia đình bệnh nhi thiếu hụt của nhóm nghiên cứu

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………….3
1.1. Tổng quan về enzyme G6PD…………………………………………………………………3
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc của enzyme G6PD…………………………………………….3
1.1.2. Chức năng của enzyme G6PD ………………………………………………………4
1.2. Bệnh thiếu enzyme G6PD …………………………………………………………………….6
1.2.1. Đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh thiếu enzyme G6PD ………………….7
1.2.2. Triệu chứng cận lâm sàng và các xét nghiệm xác định chẩn đoán
G6PD………………………………………………………………………………………12
1.2.3. Phân loại…………………………………………………………………………………..14
1.2.4. Chẩn đoán…………………………………………………………………………………16
1.2.5. Điều trị và phòng bệnh……………………………………………………………….18
1.3. Đặc điểm di truyền, đột biến gen G6PD………………………………………………..19
1.3.1. Đặc điểm di truyền …………………………………………………………………….19
1.3.2. Đặc điểm về gen và đột biến gen G6PD ……………………………………….23
1.3.3. Phân bố dạng đột biến theo địa lý ………………………………………………..28
1.4. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến G6PD…………………..30
1.4.1. Phương pháp PCR (Polymerase chain Reaction)……………………………31
1.4.2. Giải trình tự gen (DNA sequencing)…………………………………………….34
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam……………………..37
1.5.1. Trên thế giới ……………………………………………………………………………..37
1.5.2. Tại Việt Nam…………………………………………………………………………….39
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..41
2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………………41
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………………………..42
2.3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………………………….42
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu……………………………………………………………………42
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………………42
2.3.3. Chỉ số và nội dung nghiên cứu…………………………………………………….43
2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu …………………………………46
2.4.1. Vật liệu …………………………………………………………………………………….46
2.4.2. Các kỹ thuật xét nghiệm trong nghiên cứu ……………………………………46
2.5. Phân tích và xử lý kết quả……………………………………………………………………54
2.6. Các sai số và biện pháp khắc phục: ………………………………………………………55
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu…………………………………………………………55
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………..57
3.1. Một số đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu ……………………………………….57
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới …………………………………………………………….57
3.1.2. Đặc điểm về địa dư…………………………………………………………………….58
3.1.3. Đặc điểm về dân tộc…………………………………………………………………..59
3.1.4. Đặc điểm về các chỉ số hồng cầu …………………………………………………59
3.2. Xác định các đột biến gen G6PD………………………………………………………….60
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ……………………………………………………………..60
3.2.2. Kết quả chạy PCR khuếch đại các exon………………………………………..60
3.2.3. Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến……………………………………62
3.3. Phân tích đột biến gen G6PD ở một số gia đình bệnh nhi………………………..76
3.3.1. Một số đặc điểm địa dư, dân tộc của các gia đình ………………………….76
3.3.2. Tỷ lệ thiếu enzyme và đột biến gen G6PD các gia đình ………………….77
3.3.3. Đặc điểm các loại đột biến với nồng độ enzyme và kiểu di truyền gen
G6PD trong các gia đình:…………………………………………………………..79
Chƣơng 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………………………….86
4.1. Một số đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu………………………………….86
4.1.1. Đặc điểm về tuổi, giới, địa dư và dân tộc …………………………………….86
4.1.2. Đặc điểm các chỉ số hồng cầu ……………………………………………………..91
4.2. Xác định các đột biến gen G6PD………………………………………………………….92
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA ……………………………………………………………..92
4.2.2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại các exon …………………………………93
4.2.3. Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến……………………………………95
4.3. Phân tích đột biến gen G6PD ở một số gia đình……………………………………124
4.3.1. Một số đặc điểm địa dư, dân tộc của các gia đình ………………………..124
4.3.2. Phát hiện thiếu enzyme và đột biến gen G6PD các gia đình ………….124
4.3.3. Đặc điểm về nồng độ enzyme và di truyền các biến thể của gen G6PD
trong các gia đình:…………………………………………………………………..126
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………………131
KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………………………………..132
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại của tổ chức Y tế thế giới dựa vào hoạt độ enzyme và biểu hiện
lâm sàng ………………………………………………………………………………………15
Bảng 1.2. Các liên kết kiểu gen và các kiểu hình G6PD trên NST X. …………………21
Bảng 1.3. Danh sách các đột biến G6PD được mô tả gần đây đưa ……………………..26
Bảng 1.4. Các dạng đột biến G6PD hay gặp vùng khu vực Châu Á ……………………30
Bảng 2.1. Khoảng tham chiếu các xét nghiệm dòng hồng cầu ……………………………44
Bảng 2.2. Các trinh tự mồi dùng để khuếch đại 13 exon ……………………………………51
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR……………………………………………………………..52
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng giải trình tự gen……………………………………………..53
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi và giới của nhóm nghiên cứu …………………………………57
Bảng 3.2. Đặc điểm về địa dư của các đối tượng nghiên cứu……………………………..58
Bảng 3.3. Các chỉ số HC ở các trẻ thiếu hụt G6PD …………………………………………..59
Bảng 3.4. Tỷ lệ các loại đột biến được phát hiện………………………………………………63
Bảng 3.5. Xác định tỷ lệ sự kết hợp giữa các đột biến cuả gen G6PD …………………64
Bảng 3.6. Tỷ lệ đột biên phân bố theo các dân tộc tại khu vực miền Bắc…………….72
Bảng 3.7. Phân loại mức độ thiếu hụt G6PD của nhóm nghiên cứu ……………………73
Bảng 3.8. Kết quả xác định đột biến gen G6PD theo phân lớp và hoạt độ enzyme ….74
Bảng 3.9. Các dạng đột biến cuả gen G6PD với hoạt độ của enzyme theo kiểu gen ….75
Bảng 3.10. Đặc điểm địa dư, dân tộc của các gia đình ………………………………………76
Bảng 3.11. Tỷ lệ phát hiện thiếu enzyme và đột biến gen G6PD của các gia đình ..77
Bảng 3.12. Tỷ lệ phát hiện thiếu enzyme G6PD và đột biến của thế hệ ông bà…………..78
Bảng 3.13. Bảng tổng hợp về các loại đột biến theo kiểu di truyền gen ………………79
Bảng 3.14. Bảng phân bố các kiểu di truyền theo các thế hệ………………………………81
Bảng 4.1. So sánh sự phân bố các dạng đột biến G6PD phổ biến ở các các Đông Á và
Đông Nam Á theo khu vực sinh sống trong những nghiên cứu gần đây …97
Bảng 4.2. So sánh các loại đột biến ở nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu
trước đây ……………………………………………………………………………………100
Bảng 4.3. So sánh sự xuất hiện các đột biến trên các dân tộc với các nghiên cứu tại VN 115
Bảng 4.4. Bảng thống kê sự phân bố các dạng đột biến G6PD phổ biến theo các
nhóm tộc chính của các nước khu vực Đông Nam Á trong những nghiên
cứu gần đây ……………………………………………………………………………….116DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể của enzyme G6PD…………………………………………………..4
Hình 1.2. Chức năng của G6PD trong HC…………………………………………………………4
Hình 1.3. Vị trí gen G6PD trên NST X……………………………………………………………23
Hình 1.4. NST X và phân bố các đột biến trong gen G6PD. 25 …………………………..24
Hình 1.5. Các biến thể phổ biến và phân loại trong gen G6PD 77 ……………………….25
Hình 1.6. Phân bố các biến thể G6PD hay gặp trên thế giới63…………………………….28
Hình 1.7. Các dạng đột biến G6PD hay gặp ở vùng Đông Nam Á 78…………………..29
Hình 1.8. Các giai đoạn của phản ứng PCR……………………………………………………..31
Hình 1.9. Cấu trúc của ddNTP……………………………………………………………………….34
Hình 1.10. Giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động ………………………….36
Hình 1.11. Hình ảnh giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động …………….37
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi cho các exon trên gen G6PD…………………………..50
Hình 3.1. Hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 9, 10 của gen G6PD……………..60
Hình 3.2. Hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 11, 12 của gen G6PD……………61
Hình 3.3. Hình ảnh PCR đại diện khuếch đại cặp mồi F9F-9R của gen G6PD…………..61
Hình 3.4. Hình ảnh giải trình tự đột biến Gaohe trên exon 2 của gen G6PD ………..65
Hình 3.5. Hình ảnh giải trình tự đột biến Orissa trên exon 2 của gen G6PD ………..65
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự đột biến Quing Yan trên exon 5 ……………………….66
Hình 3.7. Hình ảnh giải trình tự đột biến Valladoid rên exon 5 ………………………….66
Hình 3.8. Hình ảnh giải trình tự đột biến G6PD NanKang trên exon 5………………..67
Hình 3.9. Hình ảnh giải trình tự đột biến G6PD Địa Trung Hải trên exon 5…………67
Hình 3.10. Hình ảnh giải trình tự đột biến Coimbra Shunde trên exon 5……………..68
Hình 3.11. Hình ảnh giải trình tự đột biến Viangchan trên exon 9………………………68
Hình 3.12. Hình ảnh giải trình tự đột biến Chinese-5 trên exon 9……………………….69
Hình 3.13. Hình ảnh giải trình tự đột biến Taiwan exon 9 của gen G6PD……………69
Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự đột biến Union trên exon 11 …………………………..70
Hình 3.15. Hình ảnh giải trình tự đột biến Canton và Kaiping……………………………70Hình 3.16. Hình ảnh giải trình tự đột biến c.1311C>T trên exon 11 ………………………..71
Hình 3.17. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân với lại đột biến Viangchang
(c.871G>A) ông ngoại (Hemo) truyền cho mẹ (Hete), mẹ truyền cho
con trai (Hemo). …………………………………………………………………………82
Hình 3.18. Hình ảnh giải trình tự đột biến Viangchan trên exon 9 của gen G6PD ở
gia đình bệnh nhân số 5……………………………………………………………….82
Hình 3.19. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân 11 với lại đột biến dạng Kaiping
(c.1388G>A) bà ngoại DHT (Hete) truyền cho mẹ DHT, mẹ truyền cho
con trai (Hemo)…………………………………………………………………………..83
Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự đột biến Kaiping trên exon 9 của gen G6PD ở gia
đình bệnh nhân số 35…………………………………………………………………..83
Hình 3.21. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân với lại đột biến dạng Viangchan
(c.871G>A) bà nội (Đã mất) truyền cho bố (Hemi), bố truyền cho con
gái (Hete) và cả con trai (Hemi)……………………………………………………84
Hình 3.22. Hình ảnh giải trình tự đột biến Viangchan trên exon 9 của gen G6PD ở
gia đình bệnh nhân số 24……………………………………………………………..84
Hình 3.23. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân với lại đột biến dạng Union (c. 1360
C>T) cả ông ngoại (Hemi) và bà ngoại (Hete) truyền cho con gái
(Homo), mẹ truyền cho cả con gái (Hete) và cả con trai (Hemi)……….85
Hình 3.24. Hình ảnh giải trình tự đột biến Union trên exon 11 của gen G6PD ở gia
đình bệnh nhân số 239…………………………………………………………………85
Hình 4.1. Vị trí các dạng đột biến trên gen G6PD …………………………………………..123DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Nguyên lý của kỹ thuật Formazan bán định lượng. …………………. 13
Sơ đồ 1.2. Di truyền của bệnh thiếu G6PD…………………………………………….. 19
Biểu đồ 3.1. Đặc điểm về dân tộc của các đối tượng nghiên cứu ………………. 59
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen G6PD trên các exon …………… 6