Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Cây kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), thuộc họ Cúc (Asteraceae) với thành phần hóa học chính là các flavonoid đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi hóa mạnh, ức chế sự hủy hoại tế bào gan do các tác nhân như rượu, thuốc,… đồng thời kích thích tái tạo tế bào gan; cải thiện đáng kể chức năng gan mật và ít tác dụng không mong muốn [1], [2], [3]. Trong số các hoạt chất thuộc nhóm flavonoid trong cây Kế sữa thì silybin là một chất chiếm tỉ lệ lớn (từ 50-70%) và là hoạt chất chính tạo nên tác dụng sinh học của nhóm này [1], [4]. Tuy nhiên, silybin có độ tan và tính thấm kém nên sinh khả dụng theo đường uống thấp [4], [5], [6]. Do đó, một số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm cải thiện độ tan, tính thấm và sinh khả dụng của silybin như: tạo phức với β-cyclodextrin, tạo dẫn xuất glycosid, bào chế liposome và phytosome [5], [2], [7], [8].

Trong số các biện pháp trên, bào chế hoạt chất dưới dạng phytosome được xem là hướng nghiên cứu mới, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của silybin [8], [9]. Trong phytosome các hoạt chất (cao chiết hoặc chất tinh khiết) thường là các flavonoid, polyphenol tự nhiên sẽ liên kết với phospholipid thông thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành tiểu phân có cấu trúc tương tự màng tế bào, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong dịch ruột, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác, phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh khả dụng của silybin [10].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cũng như các chế phẩm phytosome của nhiều hoạt chất như phytosome quercetin, phytosome curcumin, phytosome trà xanh, phytosome ginkgo biloba … [11]; trong đó đã có một số nghiên cứu về phytosome silybin [12], [13], [8]. Tuy nhiên, ở Việt2 Nam đến nay chưa có nghiên cứu về bào chế phytosome silybin. Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu phytosome nói chung và phytosome silybin nói riêng chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao cũng sẽ ảnh hưởng phần nào đến việc ứng dụng rộng rãi dạng phytosome vào các sản phẩm chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome silybin là cần thiết. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin” được thực hiện với hai mục tiêu sau:
1. Bào chế được phytosome silybin qui mô phòng thí nghiệm.
2. Đánh giá được sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên thực nghiệm

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ SILYBIN 3
1.1.1. Nguồn gốc 3
1.1.2. Công thức hóa học 3
1.1.3. Tính chất lý hóa 4
1.1.4. Dược động học 5
1.1.5. Tác dụng dược lý 7
1.1.6. Công dụng, liều dùng, tác dụng không mong muốn 8
1.1.7. Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống của
silybin 9
1.2. PHYTOSOME 12
1.2.1. Khái niệm 12
1.2.2. Thành phần của phytosome 13
1.2.3. Ưu, nhược điểm của phytosome 15
1.2.4. Phương pháp bào chế phytosome 16
1.2.5. Các chỉ tiêu đánh giá phytosome 21
1.2.6. Một số nghiên cứu về bào chế phytosome silybin 26
1.3. MỘT SỐ NỘI DUNG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TÁC
DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME 261.3.1. Nội dung đánh giá sinh khả dụng của phytosome 26
1.3.2. Nội dung đánh giá tác dụng bảo vệ gan của phytosome 28
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 30
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30
2.1.1. Nguyên vật liệu 30
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 31
2.1.3. Động vật thí nghiệm 32
2.1.4. Địa điểm thực hiện nghiên cứu 33
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin 34
2.2.2. Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường
diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin 48
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 55
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57
3.1. KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 57
3.1.1. Kết quả nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid 57
3.1.2. Kết quả nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phòng
thí nghiệm 67
3.1.3. Kết quả bào chế, đánh giá một số đặc tính và chỉ tiêu chất lượng
của phytosome silybin ở quy mô 150g/mẻ 88
3.1.4. Theo dõi độ ổn định của phytosome silybin 102
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC
DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 105
3.2.1. Kết quả đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin 105
3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng độc tính cấp và độc tính bán trường
diễn của phytosome silybin trên thực nghiệm 111
3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosomesilybin trên chuột cống trắng thực nghiệm 115
Chương 4. BÀN LUẬN 119
4.1. VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 119
4.1.1. Về nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid 119
4.1.2. Về nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phòng thí
nghiệm 120
4.1.3. Về đánh giá một số đặc tính của phytosome silybin 129
4.1.4. Về theo dõi độ ổn định của phytosome silybin 136
4.2. VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG
BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 137
4.2.1. Về đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin 137
4.2.2. Về đánh giá độc tính của phytosome silybin 143
4.2.3. Về đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin 143
4.3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 146
KẾT LUẬN 148
KIẾN NGHỊ 150
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ
CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1. Tỷ lệ mol của dược chất và phospholipid trong bào chế phytosome 17
1.2. Một số dung môi sử dụng trong nghiên cứu bào chế phytosome 18
1.3. Thông số nhiệt độ và thời gian phản ứng trong bào chế phytosome 19
1.4. Một số nghiên cứu về bào chế phytosome silybin 26
2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng 30
2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 31
2.3. Tương quan giữa CI và khả năng trơn chảy 47
2.4. Chương trình chạy sắc ký 49
2.5. Bố trí thử theo phương pháp chéo đôi 51
3.1. Hàm lượng silybin trong nguyên liệu 63
3.2. Độ tan của silybin trong một số dung môi 63
3.3. Độ ổn định hàm lượng của silybin ở các nhiệt độ khác nhau trong
24 giờ 64
3.4. Độ ổn định hàm lượng của PC ở các nhiệt độ khác nhau trong 24 giờ 65
3.5. Độ tan của silybin dạng phytosome trong chloroform 67
3.6. Độ ổn định của phytosome trong chloroform 68
3.7. Ảnh hưởng thời gian hòa tan đến hiệu suất phytosome hóa 68
3.8. Thông số MS của mẫu phân tích 69
3.9. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của silybin
dạng phytosome tại các thời gian phản ứng khác nhau 70
3.10. Độ lặp lại của phương pháp xác định EE% 71
3.11. Đặc tính của phức hợp Si-PC với các PL khác nhau 71
3.12. Độ ổn định của phức hợp Si-PC bào chế với các PL khác nhau 72
3.13. Ảnh hưởng dung môi phản ứng tới EE% và độ tan của silybin
trong nước 73Bảng Tên bảng Trang
3.14. Ảnh hưởng của lượng dung môi phản ứng đến EE% và độ tan
silybin trong nước 73
3.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol Si:PC đến EE% và độ tan silybin trong nước 74
3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến EE% và độ tan silybin
trong nước 75
3.17. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến EE% và độ tan silybin
trong nước 75
3.18. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến EE% và độ tan silybin
trong nước 76
3.19. Ảnh hưởng dung môi hydrat hóa đến các đặc tính của
phytosome silybin 78
3.20. Ảnh hưởng lượng nước hydrat hóa đến các đặc tính của
phytosome silybin 79
3.21. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến các đặc tính của
phytosome silybin 80
3.22. Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến các đặc tính của phytosome silybin 81
3.23. Ảnh hưởng loại tá dược hỗ trợ phun sấy đến đặc tính của bột
phytosome silybin 83
3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ TD hỗ trợ phun sấy đến đặc tính của bột
phytosome silybin 85
3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí đầu vào và tốc độ phun dịch đến các
đặc tính của bột phytosome silybin 86
3.26. Một số chỉ tiêu chất lượng mẫu bột phytosome silybin bào chế ở
quy mô 150g/mẻ 89
3.27. Độ hòa tan của silybin dạng phytosome bào chế ở quy mô
150g/mẻ 90Bảng Tên bảng Trang
3.28. Thành phần công thức bào chế phytosome silybin 150g/mẻ 91
3.29. KTTP, PDI, thế Zeta của phytosome silybin 92
3.30. Hệ số phân bố dầu nước silybin và phytosome silybin 93
3.31. Độ hòa tan của bột phytosome silybin từ 3 mẻ bào chế trong dung
dịch pH 1,2 93
3.32. Độ hòa tan của bột phytosome silybin từ 3 mẻ bào chế trong dung
dịch pH 6,8 94
3.33. Độ tan silybin dạng phytosome trong dung môi nước 94
3.34. Một số chỉ tiêu chất lượng 3 mẻ phytosome silybin bào chế quy
mô 150g/mẻ 95
3.35. Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của phytosome silybin 101
3.36. KTTP, PDI, thế Zeta của bột phytosome silybin sau thời gian bảo
quản 3 và 6 tháng ở các điều kiện khác nhau 102
3.37. Độ ẩm bột phytosome silybin sau thời gian bảo quản 3 và 6 tháng
ở các điều kiện khác nhau 103
3.38. Phần trăm hàm lượng silybin trong bột phun sấy so với thời điểm
ban đầu sau 6 tháng bảo quản 104
3.39. Độ hòa tan trong dung dịch pH 6,8 của bột phytosome silybin sau
6 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc 104
3.40. Các thông số dược động học của silybin nguyên liệu và phytosome
silybin 111
3.41. Ảnh hưởng của silybin và phytosome silybin lên hoạt độ AST và
ALT trong huyết thanh chuột bị nhiễm độc bằng PAR 116
3.42. Hình ảnh đại thể và vi thể gan chuột sau 9 ngày uống thuốc 11

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1. Công thức cấu tạo silybin A và silybin B 3
1.2. Hình minh họa quá trình phân bố và thải trừ silybin 6
1.3. Cấu trúc phân tử của phytosome 13
1.4. Cấu trúc của phospholipid 14
1.5. Cấu trúc phân tử của phosphatidyl cholin. 15
1.6. Sơ đồ bào chế phytosome theo phương pháp bốc hơi dung môi 20
2.1. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome silybin 39
2.2. Sơ đồ tiến hành làm thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào
gan trên in vivo theo mô hình gây độc gan bằng PAR 55
3.1. SKĐ của chuẩn Si-A và Si-B ở điều kiện khác nhau 57
3.2. Đồ thị mô tả mối quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ
các chất phân tích trong khoảng khảo sát 59
3.3. Sắc ký đồ của chuẩn phosphatidyl cholin ở các điều kiện khác nhau 60
3.4. SKĐ khảo sát tính chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp 61
3.5. Đồ thị mô tả mối quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ
của chất phân tích trong khoảng khảo sát 62
3.6. Phổ FT-IR: A,B- chồng phổ của các mẫu silybin ở các nhiệt độ
khảo sát. C,D- phổ của mẫu silybin ban đầu 65
3.7. Phổ FT-IR: A,B- chồng phổ của các mẫu PC ở các nhiệt độ khảo
sát. C,D- phổ của mẫu PC ban đầu 66
3.8. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phần không tan và phần tan trong dung
môi chloroform. 70
3.9. Ảnh mẫu phức hợp silybin-PC khô 77
3.10. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của phức hợp Si-PC trong môi trường
pH 1,2 và pH 6,8 77
3.11. Ảnh mẫu hỗn dịch phytosome silybin 81Hình Tên hình Trang
3.12. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của phytosome silybin (trước và sau
khi hydrat hóa) trong môi trường pH 1,2 và pH 6,8 82
3.13. Ảnh bột phun sấy các mẫu M2, M3, M4, M5, M6, M7. 84
3.14. Ảnh bột phun sấy các mẫu M7, M8, M9, M10 85
3.15. Mẫu bột phytosome phun sấy 87
3.16. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của bột phytosome silybin (trước và
sau khi phun sấy) trong môi trường pH 1,2 và pH 6,8 88
3.17. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome silybin quy mô 150g/mẻ 90
3.18. Hình ảnh chụp SEM 92
3.19. SKĐ của silybin chuẩn (a), bột phytosome silybin (b) 95
3.20. Phổ DSC: A- nguyên liệu silybin, B- nguyên liệu PC 96
3.21. Phổ FTIR: A- nguyên liệu silybin, B- nguyên liệu PC, C- hỗn hợp
vật lý, D- phức hợp Si-PC 97
3.22. Giản đồ nhiễu xạ tia X của Silybin, PC, hỗn hợp vật lý và phức
hợp Si-PC 98
3.23. Phổ 1H-NMR của (a) Silybin và (b) phức hợp Si-PC 99
3.24. Phổ 13C-NMR của (a) PC và (b) phức hợp Si-PC 100
3.25. Hình ảnh chụp SEM, TEM của mẫu bột phytosome silybin sau 6
tháng ở ĐK thường (a) và lão hóa cấp tốc (b) 102
3.26. SKĐ mẫu (A) huyết tương trắng, (B) silybin trong huyết tương 105
3.27. SKĐ mẫu huyết tương trắng (A), mẫu silybin trong huyết tương
(B) của hai phương pháp xử lý mẫu 106
3.28. Đồ thị mô tả mối quan hệ tuyến tính của diện tích pic và nồng độ
các chất phân tích trong khoảng khảo sát 107
3.29. Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của 6 cá thể
chó sau khi uống silybin và phytosome silybin 110
3.30. Hình thái vi thể gan chuột sau 28 ngày uống thuốc thử (HE x 400) 114
3.31. Hình ảnh vi thể thận chuột sau 28 ngày uống thuốc thử (HE x 400) 1