Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của lá cây Xấu hổ

Luận án tiến sĩ dược học Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) trên thực nghiệm.Đái tháo đường (ĐTĐ) là một rối loạn chuyển hóa mạn tính với tỷ lệ mắc bệnh đang gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây, đặc trưng bởi lượng đường huyết tăng cao dẫn đến suy giảm nghiêm trọng chức năng tim mạch, mắt, thận và thần kinh. Bệnh ĐTĐ típ 2 là do sự đề kháng với insulin hoặc thiếu insulin do tế bào β tuyến tụy tiết ra không đủ hoặc kết hợp cả hai [1]. Theo dữ liệu gần đây nhất của Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation – IDF): 537 triệu người- khoảng 10,5% tổng số người trong độ tuổi 20-79 trên thế giới đang chung sống với bệnh đái tháo đường tính đến năm 2021. Con số này dự kiến sẽ tăng lên 643 triệu vào năm 2030 và 783 triệu vào năm 2045 [2]. Hơn nữa, ước tính có khoảng 240 triệu người mắc bệnh đái tháo đường hiện chưa được chẩn đoán. Tại Việt Nam, kết quả điều tra của Bộ Y tế năm 2021 cho thấy tỷ lệ mắc đái tháo đường ở người trưởng thành ước tính là 7,1%, tương đương với khoảng gần 5 triệu người đang mắc bệnh đái tháo đường. Trong đó, số đã được chẩn đoán chỉ chiếm khoảng 35% và số đang được quản lý, điều trị tại các cơ sở y tế chiếm 23,3%. Theo dự báo, số mắc đái tháo đường của Việt Nam cũng như toàn thế giới sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới [3]. Hiện nay có một số nhóm thuốc điều trị ĐTĐ nhưng hiệu quả còn hạn chế, các thuốc hầu như không có tác dụng hạ glucose huyết lâu dài kể cả khi đã dùng phối hợp, hiệu quả ngăn ngừa biến chứng thấp, còn nhiều tác dụng không mong muốn, một số thuốc gây tăng cân, gây hạ đường huyết quá mức, buồn nôn, nôn, tiêu chảy… Do vậy, nghiên cứu các thuốc điều trị ĐTĐ hiệu quả và ít tác dụng phụ là rất cần thiết.
Tại các nước có nền y học cổ truyền phát triển như Việt Nam, bên cạnh các phương pháp y học hiện đại, các bài thuốc, vị thuốc đang được nghiên cứu ngày càng sâu để góp phần điều trị các bệnh, trong đó có bệnh đái tháo đường. Cây Xấu hổ là một dược liệu mọc hoang ở nhiều vùng của nước ta và đã được chứng minh sơ bộ là có tác dụng chống viêm, an thần, giảm đường huyết và có thể có tác dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường. Nguồn cung cấp nguyên liệu2 về cây Xấu hổ rất tiềm năng. Việc phát triển các dược liệu thành thuốc hoặc các sản phẩm bảo vệ sức khỏe theo hướng chống đái tháo đường đang rất cần thiết.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy cây Xấu hổ chứa các nhóm hợp chất như alkaloid, terpenoid, glycoprotein, crocetin dimethyl ester, phytosterol, glycosid, flavonoid, quinon, hợp chất phenolic, saponin, coumarin và tanin [4].
Một tác giả khác cũng phân lập được từ phân đoạn EtOAc của cao chiết Xấu hổ các hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase như: stigmasterol; quercetin; avicularin [5]. Nhìn chung, các nghiên cứu về cây Xấu hổ còn rời rạc, chưa có nghiên cứu toàn diện bao gồm cả in silico, in vitro và in vivo về tác dụng và cơ chế tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường của cây Xấu hổ. Do đó, nghiêncứu làm sáng tỏ tác dụng và cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cao phân đoạn và các hợp chất của cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) trên bệnh đái tháo đường là rất cần thiết. Do đó, nghiên cứu này tập trung đánh giá tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, hạ lipid máu, cải thiện biến chứng tổn thương thận và sơ bộ cơ chế tác dụng chống đái tháo đường của cao chiết lá cây Xấu hổ. Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ góp phần vào cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về tác dụng dược lý của cây Xấu hổ có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường, từ đó đề xuất khả năng ứng dụng theo hướng làm thuốc điều trị bệnh đái tháo đường của cây Xấu hổ, và phát triển nguồn dược liệu Việt.
Do vậy, luận án “Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của lá cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) trên thực nghiệm.” được tiến hành nhằm mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng hạ đường huyết và một số tác dụng liên quan đến đái tháo đường của cao chiết lá cây Xấu hổ trên thực nghiệm.
2. Đánh giá cơ chế tác dụng chống đái tháo đường của cao chiết và hai hợp chất chiết xuất từ lá cây Xấu hổ in vitro và in silico

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………………………… 1
Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………………………………………. 3
1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường…………………………………………………….. 3
1.1.1. Phân loại ĐTĐ……………………………………………………………………………… 3
1.1.2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh bệnh ĐTĐ típ 2 …………………………….. 4
1.2. Một số đích phân tử trong điều trị đái tháo đường típ 2 …………………………. 9
1.2.1. 5'- Adenosin monophosphat-activated protein kinase (AMPK)…………….. 9
1.2.2. Alpha-glucosidase (α-glucosidase) ………………………………………………….. 9
1.2.3. Protein tyrosin phosphatase 1B (PTP-1B)……………………………………….. 10
1.2.4. Advanced glycation end products (AGEs) ………………………………………. 11
1.2.5. Methyl glyoxal và sự hình thành các AGEs …………………………………….. 12
1.3. Các biến chứng của bệnh ĐTĐ ………………………………………………………… 16
1.3.1. Các biến chứng cấp tính: ……………………………………………………………… 16
1.3.2. Biến chứng thận do đái tháo đường ……………………………………………….. 16
1.3.3. Các biến chứng khác của đái tháo đường………………………………………… 17
1.4. Các nhóm thuốc dùng trong điều trị ĐTĐ………………………………………….. 18
1.4.1. Insulin ………………………………………………………………………………………. 18
1.4.2. Các thuốc làm tăng tiết insulin………………………………………………………. 20
1.4.3. Các thuốc làm tăng nhạy cảm của tế bào đích với insulin: …………………. 22
1.4.4. Thuốc ức chế enzym alpha- glucosidase…………………………………………. 23
1.4.5. Chất ức chế đồng vận chuyển natri-glucose 2 (SGLT-2i) ………………….. 24
1.4.6. Các thuốc điều trị đái tháo đường khác…………………………………………… 24
1.5. Một số mô hình gây micrĐTĐ típ 2 thực nghiệm trên động vật…………….. 25
1.5.1. Mô hình streptozotocin/ alloxan ……………………………………………………. 26
1.5.2. Mô hình ăn chế độ ăn giàu chất béo……………………………………………….. 27
1.5.3. Mô hình kết hợp chế độ ăn giàu chất béo và STZ. ……………………………. 27
1.5.4. Mô hình gây ĐTĐ típ 2 bằng phương pháp biến đổi gen …………………… 28
1.5.5. Mô hình ĐTĐ típ 2 nguyên phát:…………………………………………………… 28
1.6. Tổng quan về nghiên cứu in silico ……………………………………………………. 28
1.6.1. Docking phân tử (Molecular docking) ……………………………………………. 29
1.6.2. Mô phỏng động lực học phân tử ……………………………………………………. 31
1.6.3. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc…………………………………………………. 32
1.6.4. Dự đoán ADMET ……………………………………………………………………….. 32
1.7. Tổng quan về cây Xấu hổ ……………………………………………………………….. 33
1.7.1. Vị trí phân loại: ………………………………………………………………………….. 33
1.7.2. Đặc điểm thực vật và phân bố……………………………………………………….. 33
1.7.3. Thành phần hóa học…………………………………………………………………….. 34
1.7.4. Tác dụng dược lý………………………………………………………………………… 36Chương 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU …………………………………………………………………………………………. 39
2.1. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu………………………………………………….. 39
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ………………………………………………………………….. 39
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………….. 39
2.1.3. Thiết kế liều thử cho mẫu nghiên cứu…………………………………………….. 39
2.1.4. Động vật thí nghiệm ……………………………………………………………………. 39
2.1.5. Hóa chất, thuốc thử……………………………………………………………………… 40
2.1.6. Trang thiết bị, phương tiện, dụng cụ ………………………………………………. 41
2.1.7. Địa điểm nghiên cứu……………………………………………………………………. 43
2.2. Nội dung nghiên cứu: …………………………………………………………………….. 43
2.3. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………… 45
2.3.1. Phương pháp thử nghiệm dung nạp glucose…………………………………….. 45
2.3.2. Phương pháp đánh giá các tác dụng của phân đoạn có tác dụng tốt nhất
trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ kiểu típ 2 do chế độ ăn giàu chất béo và
streptozotocin……………………………………………………………………………………… 47
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α- glucosidase và PTP-1B của hợp
chất chính phân lập được từ cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) trên mô hình in
silico ……………………………………………………………………………………………. 56
2.3.4. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α- glucosidase và PTP-1B của hợp
chất chính phân lập được từ cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) in vitro………….. 59
2.3.5. Tác dụng ức chế của phân đoạn EtOAc và hai hợp chất đối với độc tính
glucose trên dòng tế bào HUVECs …………………………………………………………. 60
2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành AGEs do MGO gây
ra ……………………………………………………………………………………………. 62
2.3.7. Phương pháp đánh giá tác dụng của phân đoạn cao chiết EtOAc và hai
hợp chất đối với thử nghiệm MGO-AGEs breaker (phá vỡ MGO-AGEs) …….. 64
2.4. Xử lý số liệu…………………………………………………………………………………. 64
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………. 66
3.1. Đánh giá tác dụng hạ đường huyết và một số tác dụng liên quan đến đái
tháo đường của cao chiết lá cây Xấu hổ trên thực nghiệm. …………………………. 66
3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao toàn phần (MP) và
các cao phân đoạn theo phương pháp dung nạp glucose đường uống (OGTT)
trên chuột bình thường …………………………………………………………………………. 66
3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ
trên mô hình chuột bị gây ĐTĐ típ 2 do chế độ ăn giàu chất béo và
streptozotocin. …………………………………………………………………………………….. 68
3.1.2.1. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
glucose máu ……………………………………………………………………………………….. 68
3.1.2.2. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
lipid máu ……………………………………………………………………………………………. 693.1.2.3. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cao chiết lá cây Xấu hổ lên
microalbumin niệu ………………………………………………………………………………. 70
3.1.2.4. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
creatinin máu, creatinin niệu và hệ số thanh thải creatinin………………………….. 71
3.1.2.5. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên tình trạng
viêm ở mô thận chuột …………………………………………………………………………… 73
3.1.2.6. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên quá trình
stress oxy hóa ở chuột ………………………………………………………………………….. 75
3.1.2.7. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cao chiết lá cây Xấu hổ lên mô
bệnh học thận của chuột ……………………………………………………………………….. 79
3.2. Kết quả đánh giá cơ chế tác dụng chống đái tháo đường của cao chiết và hai
hợp chất chiết xuất từ lá cây Xấu hổ in vitro và in silico. …………………………… 82
3.2.1. Kết quả in vitro thử tác dụng ức chế α-glucosidase và PTP-1B của các hợp
chất phân lập được. ……………………………………………………………………………… 82
3.2.2. Kết quả in silico thử tác dụng ức chế α-glucosidase và PTP-1B của các
hợp chất phân lập được…………………………………………………………………………. 83
3.2.2.1. Đánh giá mô hình docking…………………………………………………………. 83
3.2.2.2. Kết quả docking……………………………………………………………………….. 85
3.2.2.3. Đánh giá khả năng giống thuốc theo quy tắc Lipinski…………………….. 87
3.2.2.4. Phân tích các thông số dược động học (ADMET) của hai hợp chất ….. 87
3.2.3. Kết quả động lực học phân tử ……………………………………………………….. 89
3.2.4. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ của phân đoạn EtOAc và hai hợp chất
đối với độc tính methylglyoxal (MGO) …………………………………………………… 92
Chương 4. BÀN LUẬN……………………………………………………………………….. 97
4.1. Về tác dụng hạ đường huyết và một số tác dụng liên quan đến đái tháo
đường của cao chiết lá cây Xấu hổ trên thực nghiệm:………………………………… 98
4.1.1. Về đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết toàn phần và các
phân đoạn của cao chiết lá cây Xấu hổ theo phương pháp dung nạp glucose
đường uống (OGTT) ……………………………………………………………………………. 98
4.1.2. Về kết quả tác dụng và cơ chế tác dung của phân đoạn EtOAc trên mô ̣
hình gây bệnh ĐTĐ típ 2 trên chuột ……………………………………………………… 101
4.2. Về cơ chế tác dụng chống đái tháo đường của cao chiết và hai hợp chất
chiết xuất từ lá cây Xấu hổ in vitro và in silico……………………………………….. 109
4.2.1. Về cơ chế tác dụng ức chế hai enzym α-glucosidase và PTP-1B của hai
hợp chất acid protocatechuic và acid syringic…………………………………………. 109
4.2.2. Về tác dụng và cơ chế tác dụng bảo vệ tế bào khi nồng độ đường huyết
tăng cao của phân đoạn EtOAc và hai hợp chất theo cơ chế giảm tác dụng độc
tính của MGO …………………………………………………………………………………… 111
4.3. Bàn luận chung về tác dụng dược lý theo hướng điều trị bệnh đái tháo
đường của cây Xấu hổ………………………………………………………………………… 113
4.4. Đóng góp mới của luận án…………………………………………………………….. 116
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………………. 118KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………………………… 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: Phiếu kết quả giám định mẫu cây Xấu hổ.
PHỤ LỤC 2: Phương pháp chiết xuất dược liệu và phân lập các hợp chất.
PHỤ LỤC 3: Phụ lục các phổ.
PHỤ LỤC 4: Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của cao Xấu hổ phân đoạn
EtOAc

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát ………………………………………………… 4
Bảng 1.2. Một số loại insulin…………………………………………………………………. 19
Bảng 1.3. Lượng flavonoid toàn phần- total flavonoid (TF) và lượng phenol toàn
phần- total phenolic (TP) có trong cắn chiết từ toàn thân cây Xấu hổ và cắn chiết
của từng bộ phận riêng biệt như: lá, hạt, thân cây Xấu hổ…………………………… 34
Bảng 2.1. Một số hóa chất, thuốc thử chính sử dụng …………………………………. 40
Bảng 2.2. Một số trang thiết bị, dụng cụ chính sử dụng ……………………………… 42
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm dung nạp glucose đường uống với cao toàn phần
và các phân đoạn cao chiết lá cây Xấu hổ………………………………………………… 66
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm dung nạp glucose đường uống đối với phân đoạn
EtOAc của cao chiết lá cây Xấu hổ ………………………………………………………… 67
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
lipid máu ngày thứ 60…………………………………………………………………………… 69
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
creatinin máu, creatinin niệu và hệ số thanh thải creatinin ngày thứ 60. ……….. 71
Bảng 3.5. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP-1B của các hợp chất
phân lập được……………………………………………………………………………………… 83
Bảng 3.6. Kết quả docking các hợp chất………………………………………………….. 85
Bảng 3.7. Kết quả phân tích quy tắc Lipinski 5 của 2 hợp chất……………………. 87
Bảng 3.8. Kết quả dự đoán ADMET ………………………………………………………. 88DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin…………………………………….. 6
Hình 1.2. Cơ chế phân tử của tính kháng insulin ………………………………………… 7
Hình 1.3. Sự hình thành MGO và AGEs trong bệnh ĐTĐ típ 2…………………… 15
Hình 2.1. Sơ đồ chung về các nội dung nghiên cứu …………………………………… 44
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm dung nạp glucose đường uống với cao tổng và các
phân đoạn cao chiết lá cây Xấu hổ …………………………………………………………. 46
Hình 2.3. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng của các mẫu nghiên cứu có tác
dụng tốt nhất trên chuột bị gây ĐTĐ típ 2 bởi STZ ………………………………….. 49
Hình 2.4. Nguyên lý của phương pháp MTT …………………………………………… 61
Hình 3.1. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
glucose máu ở chuột…………………………………………………………………………….. 68
Hình 3.2 Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc của cao chiết lá cây Xấu hổ lên
microalbumin niệu ngày thứ 60 ……………………………………………………………… 70
Hình 3.3. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
TNF –α trên mô thận chuột ngày thứ 60………………………………………………….. 73
Hình 3.4. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
IL-1β trên mô thận chuột ngày thứ 60 …………………………………………………….. 74
Hình 3.5. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên quá
trình peroxy hóa lipid ngày thứ 60………………………………………………………….. 75
Hình 3.6. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
SOD ngày thứ 60…………………………………………………………………………………. 76
Hình 3.7. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
CAT ngày thứ 60…………………………………………………………………………………. 77
Hình 3.8. Ảnh hưởng của phân đoạn EtOAc cao chiết lá cây Xấu hổ lên nồng độ
GPx ngày thứ 60………………………………………………………………………………….. 78
Hình 3.9. Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột nhóm thường (HE x 400) ……… 80
Hình 3.10. Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột nhóm chứng bệnh (HE x 400) . 80
Hình 3.11. Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột nhóm được điều trị với glyclazid
5 mg/kg (HE x 400) ngày thứ 60. …………………………………………………………… 81Hình 3.12. Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột nhóm được điều trị với cao chiết
MP- E liều 50 mg/kg (HE x 400) ngày thứ 60. …………………………………………. 81
Hình 3.13. Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột nhóm được điều trị với cao chiết
MP- E liều 100 mg/kg (HE x 400) ngày thứ 60. ……………………………………….. 82
Hình 3.14. Vùng hoạt động và kết quả redock của hai mục tiêu. …………………. 84
Hình 3.15. Minh họa 2D tương tác giữa hai phối tử đồng tinh thể và protein của
chúng. ……………………………………………………………………………………………….. 85
Hình 3.16. Minh họa 2D tương tác giữa hai hợp chất và mục tiêu. ………………. 86
Hình 3.17. RMSD của phức hợp isomaltase-acid protocatechuic (A) phức hợp
PTP-1B-acid protocatechuic (B) trong 600ps mô phỏng động lực học phân tử. 90
Hình 3.18. Năng lượng tự do của phức hợp isomaltase- acid protocatechuic (A)
phức hợp PTP-1B- acid protocatechuic (B) trong 600ps mô phỏng động lực học
phân tử. ……………………………………………………………………………………………… 90
Hình 3.19. RMSD của phức hợp isomaltase- acid syringic (A) phức hợp PTP-
1B- acid syringic (B) trong 600ps mô phỏng động lực học phân tử. …………….. 91
Hình 3.20. Năng lượng tự do của phức hợp isomaltase- acid syringic (A) phức
hợp PTP-1B- acid syringic (B) trong 600ps mô phỏng động lực học phân tử. .. 91
Hình 3.21. Tỷ lệ sống sót của tế bào HUVECs sau khi được điều trị với phân
đoạn EtOAc và hai hợp chất và aminoguanidin trong hai trường hợp có và
không có MGO……………………………………………………………………………………. 93
Hình 3.22. Khả năng ức chế hình thành AGEs do MGO gây ra sau khi điều trị
bằng của các mẫu thử ………………………………………………………………………….. 94
Hình 3.23. Khả năng phá vỡ AGEs của các mẫu thử được nghiên cứu thông qua
số lượng amin tự do sinh ra sau phản ứng MGO-BSA……………………………….. 96
Hình 4.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu tác dụng và cơ chế tác dụng của cây Xấu
hổ trong hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ ………………………………………………………… 11